Тема 3 микроскопски методи на изследване

Очаквано идентификация на микроорганизми в пробата.

Проучване някои морфологични характеристики и структури на микроорганизми (например, капсули, камшичета и т. Д).

Изследването на оцветени петна на колонии и чисти култури.

Към днешна дата, най-често използваният е светлинна микроскопия.

Светлинна микроскопия осигурява увеличена до 2-3 хиляди пъти, цвят и движеща се картина на живо същество, microcinematography възможността и дълго наблюдение на един и същ обект, да се оценят нейната динамика и химията. Светлинен микроскоп изображение се формира поради факта, че един обект и неговите различни структури селективно абсорбират светлината на различни дължини на вълните (контрастни абсорбция) или поради светлинна вълна промяна на фазата, когато светлината преминава през обект (фазов контраст) на.

Основните характеристики са всеки микроскоп разделителна способност и контраст. Резолюция - минималното разстояние, на което две точки са изложени отделно микроскоп. Разделителната способност на човешкото око в най-добрия режим на визията е 0,2 мм. контраст на изображението - разликата на яркост и фоново изображение. Ако тази разлика е по-малко от 3-4%, не е възможно да се избегне всякакво око или фотографска плака; Тогава изображението ще остане невидим дори когато микроскоп решава неговите детайли. Контрастът влияние върху свойствата на обекта, промяна на силата на светене в сравнение с фона, както и способността да улови оптиката, настъпили различия в свойствата на лъча. Възможността за светлинен микроскоп, е ограничено от вълна характер на светлината. Физични свойства на светлина - цвят (дължина на вълната), яркост (амплитуда на вълна) фаза, плътността и посоката на разпространение на вълната се променят в зависимост от свойствата на обекта. Тези различия и се използват в съвременните микроскопи, за да създадете контраст.

Увеличение на микроскоп се определя като продукт с по-голям обектив на увеличението на окуляра. В типичен изследвания микроскоп окуляр увеличение е 10, а увеличението лещите - 10, 40 и 100. Следователно, увеличаването на микроскопа е от 100 до малка от 1 000 Някои микроскопи имат повишен до 2 000. Още по-голямо увеличение е безсмислено, тъй като където резолюцията не се подобрява. За разлика от това, качеството на изображението се влошава.

Числовата апертура се използва за изразяване на резолюцията на оптичната система. Числена апертура - това е оптична "покритие" на обектива, това е мярка за количеството светлина, което влиза на обектива. Числовата апертура на обектива е показан на джантата. Отворът на кондензатора трябва да съвпада с числовата апертура на обектива. Всеки цифров обектив, граничещи с въздух (т.е., "сух система"), не може да надвишава 1, от индекса на пречупване на въздуха е 1. цифров отвор може да бъде подобрено чрез увеличаване на коефициента на пречупване на средата между предната обектива и плъзгача, привеждането й в индекса на пречупване на стъкло (1.5). За тази цел между предната обектива и обекта при разследване се поставя капка течност с индекс на пречупване по-голяма от рефрактивния индекс на въздуха, например, капка вода (п = 1,3), глицерол (п = 1,4) или кедър (потапяне) масло (п = 1,5). За всеки от горните течности произведени специални лещи, наречени потапяне.

Светлинна микроскопия включва конвенционален предаване микроскопия (светлина, тъмно поле), фазово-контрастен, флуоресцентен. Наскоро разработени други начини за микроскопи и микроскопия - инверсия ikonfokalnaya лазерно сканиране микроскопия.

Brightfield микроскопия дава възможност да се изследват обектите в преминаваща светлина ярка област. Този тип микроскопия за морфологични изследвания, размера на клетката, техните относителни позиции, структурната организация на клетките и други функции. В светлинен микроскоп максимална разделителна способност от 0,2 микрона, което осигурява висока точност на микроскоп увеличение до 1500h.

Фаза контрастна микроскопия позволява по-ясно да се наблюдава на живо прозрачни обекти, които имат индекси на рефракция, в близост до коефициентите на пречупване на средата. Действието на микроскоп фазово-контрастен се основава на намесата на светлина в равнината на изображението, причинено от фазово изместване (използвайки пръстените фаза в мембраната на диафрагмата). Когато микроскопия на фазово-контрастен често се използва биологични микроскопи с обратен подреждане на оптика - обърнат микроскоп. Такива микроскопи, обективи са разположени от дъното, и кондензатора - отгоре.

Чрез използване на фазово-контрастен микроскоп проучване на формата, размера, относителната позиция на клетките, тяхната подвижност, размножаване, поникване на спори на микроорганизми, и така нататък. D. Чрез използване на този метод на микроскопия контраст на живот, неоцветени микроорганизми увеличава драстично и те изглеждат тъмни на светъл фон (положителен фазов контраст ) или светлина на тъмен фон (отрицателно фазов контраст).

Darkfield микроскопия се основава на осветлението на обекта косите лъчи на светлината. В този светлинните лъчи не въведете обектива, така че зрителното поле се появява тъмно. Такъв препарат се постига чрез използване специално осветление Darkfield кондензатор. Darkfield микроскопия е много прост, но ефективен метод и е подходящ за живеене, така и за изображения неоцветени биологични проби. Като се има предвид лекотата на инсталиране, качеството на изображенията е много добро.

Когато микроскопия в тъмно поле, можете да видите обекти, чиято стойност се измерва в стотни от микрометър, което е отвъд разделителната способност на конвенционален микроскоп светло. Въпреки това, наблюдението на обекти в тъмното поле позволява да разследва само контурите на клетките и не дава възможност за оценка на тяхната вътрешна структура.

Fluorescent (флуоресценция) микроскопия се основава на способността на редица вещества от биологичен произход, или на някои бои светят когато са осветени невидима ултравиолетова или синя светлина. При използване на светлинен микроскоп ултравиолетова разделителна способност може да бъде до 0.1 микрона.

Клетките на микроорганизми, лекувани със специални багрила - флуорохроми (акридин оранж, primulin, родамин, и т.н.) като силно разредени водни разтвори на 1: 500-1: 100 000. Такива разтвори са слабо токсични, което прави възможно да се изследва интактна клетка. В зависимост от химичния състав, клетъчната структура в различна степен и абсорбират бои Luminesce до различен начин. В допълнение, Флуорохромните неравномерно адсорбирани живи и мъртви клетки. Това позволява използването на този тип микроскопия за цитологични и имунологични изследвания, определяне на клетъчната жизнеспособност и т. D.

Електронна микроскопия може да открива обекти, които не са разрешени при използване на леки или ултравиолетови лъчи. Теоретично razreshenieprosvechivayuschego електронен микроскоп е 0.002 пМ; реалното преодоляване на съвременните електронни микроскопи е в близост до 0,1 нанометра. На практика решението за биологични обекти до 2 нанометра.

Късата дължина на вълната на електроните позволява да се разграничат обекти в размера на 0.5-1.0 пМ. В съвременните електронни микроскопи на екрана са постигнали увеличение 5000- 200 000. С такава висока резолюция, е възможно да се определи части от бактериални структури. Например, като се използва отлагане на соли на тежки метали околните бактерии и проникват в нередности повърхностните се получава опацификация поради диференциално забавяне електрони. Този ефект се нарича отрицателна разлика.

Електронно микроскопска, в която се формира изображение през прохода (рентгенови снимки на) електрони чрез образеца, тя се нарича една прозрачна (или съоръжение).

микроскопия на SEM (сканиращ електронен (SEM), електронен лъч бързо сканира повърхността на пробата, което води до радиация, която е образ на светлинен екран. За REM се характеризира с висока резолюция, широк спектър от увеличение (до 100 000 и по-горе), голяма дълбочина на фокуса (

100 микрона), различни режими на работа. Сканиране микроскоп дава представа за повърхности и позволява да се получи триизмерен образ.

Лазерно конфокална микроскопия дава възможност да се получи ясно изображение и да видите обекти на фокус върху цялата област. Този метод е подходящ само за изследване на самостоятелно светлинен (флуоресцентни) обекти. Когато се комбинира с Изчисляване техника за пространствена реконструкция на обекта се проучва. В конфокални микроскопски изображения лазерно сканиране на вътрешните напречни сечения са оформени чрез сканиране на фокусиран лазерен лъч върху различни (405, 488, 532, 635 пМ) лазер и на пространствено филтриране на радиацията. При използване на сканираща микроскопия близък обхват (SMBP), има висока разделителна способност. Най-малкият размер на получения от SMBP елемент е 20 пМ при дължина на вълната от 0.486 пМ светлина. В елемент на изображението контролирано не дифракционни или смущения ефекти, които пречат на определяне на неговите граници. SMBP отличителна черта в сравнение с микроскоп атомната сила е чувствителността на оптичните характеристики на повърхността на тест-проба, дължината на вълната на светлината, луминисценция и др.

Компютърна намеса микроскопия дава възможност да се получат изображения с висок контраст под ръководството на субклетъчно структури; В много случаи се използва за проучване живи клетки. Принципът на работа на автоматизиран микроскоп смущения на базата на намесата на леки лазерни лъчи, отразени от референтната огледалото и огледалото в която е поставена измерва фаза обект. Теоретично, максималната постижима резолюция може да бъде средно 0.2 пМ, практически е 0.4 микрона.

Рентгенова компютърна томография (КТ), позитронна емисионна томография (PET) дава възможност да се наблюдава обекти в нормални условия.