свързване на комплемента

Начало | За нас | обратна връзка

свързване на комплемента (РСК) се основава на факта, че специфичен антиген - антитяло всички Глобални Депозиторски адсорбира върху себе си (връзки) комплемента.

Тази реакция е широко използван за идентифициране на антигени и по-специално клане serodiagnosis инфекции, причинени от спирохети timetotal * (Wasserman) rikketsiyamy и вируси.

DGC - комплекс серологични реакции. В нея преподаване съществуват и допълват двете системи антиген - антитяло. По същество, тези два серологични тестове.

Първата система - на TiO п п I се състои от антиген и антитяло (добре познат, а другият не). Към това се добавя определено количество допълнение. Когато съответният антиген и антитела на тази система, те се свързват и да се свързват комплемента. Полученият комплекс на фино диспергирана и-, не се вижда.

Върху формирането на този комплекс се разпознава от втората система или хемолитична план индикатор. Състои се от овчи червени кръвни клетки (антиген) и съответно, съответстващи на тях-хемолитични серум (антитяло), т. Е. готов, имунен комплекс. В тази система, червено лизиране на клетката може да се случи само в присъствието на комплемента. Ако първата системата е свързана допълнение (с съответствие с неговия антиген и антитела), втората от хемолиза система няма - защото няма свободен допълнение. Липса на хемолиза (съдържа ми-мътни тръби или утаи на дъното й червените кръвни клетки) се отчита като положителен резултат RSK.

Ако антигена не е подходящ антитяло, имунната Комплексът се формира и компле-среда ще остане безплатно в първата система! Останалите свободен, царевично plement възпроизвеждане на втората система, което води до хемолиза, - средно нови отрицателен резултат (съдържанието на епруветките са прозрачни - "лак кръв").

Компоненти за свързване на комплемента:

Антиген - обикновено лизат, екстракт, хаптън; по-малко суспензия.

1.Antitelo-серум от системата на пациента
2. комплемента - серум от морски свинчета

3.Antigen - овчи еритроцити

4.Antitelo - хемолитична да овчи еритроцити

Тъй като RNC участва в голям брой slozhnyhkomponentov, те трябва да бъдат предварително титрува ivzyaty взаимодейства в точните количества и в равни количества: 0,5ili 0.25, най-малко 0,2 мл. Съответно, цялата изпитване бе проведено vobemah 2.5, 1.25 или 1.0 мл (големи обеми осигуряват резултати boleetochny ТАТ). Титруване на реакционните компоненти се извършва vtom същата степен, че се получава опит заместване nedostayuschieingredienty изотоничен разтвор.

Хемолитична серум (хемолизин). Серумът се разрежда три пъти по-малко от титъра (вж. Стр 211). Приготвя общо разреждане на серум за целия експеримент, обемът на което се определя чрез умножаване на обема на серум в една тръба (например, 0.5 мл) на броя на тръби малко повече от броя на експеримента.

2.Eritrotsity овен. Получава се 3% суспензия на промит овчи червени кръвни клетки (вж. Стр 211) към цялото тегло на тръби в експеримента. За да се подготви хемолитична система за 30 минути преди въвеждането му в опит смесени равни обеми от разредения суспензията от еритроцити и хемолизин, растящите серум на еритроцити, напълно смесени и инкубирани за 30 минути при 37 # 730 С.

3.Komplement обикновено разрежда 1:10. Преди всеки експеримент трябва да се титрира. Тигърът на комплемента - това е най-малко количество, което, когато се добавят към системата претърпява пълно хемолитична хемолиза продължение на 1 час при 37 # 730 С. Схема титруване на комплемента са представени в Таблица 21.

Внимание! Подарък титриран в същата степен, в която сложи главния опит, замените липсващите съставки изотоничен разтвор.

Анализ на рентабилността. Контролите не трябва да бъдат още по-хемолиза, като един от тях не е допълнение, в другата - хемолизино. Контролите показват липса на компоненти gemotoksichnosti реакция (спонтанно способност да лизират червени кръвни клетки).

В горната таблица. Пример 21 титър на комплемента в 1:10 разреждане е 0.15 мл. В експеримент активност на комплемента може да се намали поради неспецифичната адсорбция на другите компоненти на неговата реакция, така опит количество комплимент повишена: като титър след дозата. Това - работа доза. В този пример е 0.2 до 1:10 разреждане на комплемента. Тъй като всички компоненти, участващи в RNC, трябва да се вземат в равни обеми (в нашия пример е равно на 0: 5 мл), е необходимо да се дозира работната комплемента (СО1 0.2: 10) да се добавят 0.3 мл изотоничен разтвор. За всички изпитате силата на звука на всеки един от тях (и допълни изотоничен разтвор.

За всички изпитат Обемът на всяка от тях (комплемента и изотоничен разтвор), умножена по броя на тръби, участващи в RNC. Например, за експеримента в епруветки 50 трябва да се вземат 10 мл допълва 01:10 (mlh50 0.2) и 15 мл изотоничен разтвор (0.3 mlh50).

4. Антигенът обикновено получава готов показва своята титър, т.е. сумата, която се съдържа в 1 мл антиген след разреждане. например, титър от 0.4 в своята разреден в 0.96 мл изотоничен разтвор. Опитът на антиген получи количество, равно на половината титър (0.5 мл). Тази доза от своята работа. Споменатата обща антиген разреждане за целия експеримент 0.5 мл умножаване на броя на тръбите в експеримента.

5. Антитялото - серум на пациента. Пресен серум преди експеримента инактивиран да унищожи допълнение на съществуващите в тях. За тази цел се нагрява в продължение на 30 минути при 56 # 730 С водна баня или инактиватор с терморегулатор. Последният метод е за предпочитане: елиминира възможността от прегряване серум, т.е., неговата денатурация ... Денатуриран syvo-Ротко не са подходящи за преживяното. В серума на пациента обикновено се използва при разреждане от 1:10 до 1: 160.

Осигуряване на основния експеримент

При създаването на опита изключително; се добавят дебит компоненти основни последователности. Експериментът се извършва на два етапа.

Фаза I. Епруветките се излива желания размер на изотоничен разтвор на натриев хлорид, след това - на необходимия обем разреден серум и в същия работен обем доза антиген и допълва. Опитът ще придружава контрола на всички участващи компоненти: серум антигенът, хемолитична система допълнение.

Епруветките бяха старателно завихрят и се инкубират при 37 ° С 45 минути, 1 час, или при 4 ° С ( "студен RSK") в продължение на 18 часа. През това време, наличието на специфичен комплекс-prois отива допълва свързване. Взаимодействие "студен" значително увеличава неговата чувствителност и специфичност.

Фаза II. След инкубиране всички епруветки се прибавя 1 мл хемолитична система, която предварително се инкубира 30 минути (сензорно biliziruyut). Епруветките се разклащат и поставят обратно в инкубатора.

Въз основа на резултатите от ин. Епруветките се оставят в термо-Stat до пълно хемолиза на 2, 3, 6 и 7 тръби (серумен контрол, антиген и допълват за една и две дози). На първо място хемолиза се случва в 7-та флакона, което е в двоен размер на комплемента. Щом това се случи витро хемолиза и съдържанието му ще бъдат напълно прозрачни, трябва много внимателно да се следват останалите контроли. Веднага след като течността в 2, 3 и 6 тръби станат прозрачни, следата незабавно отстраняване на статива с плитък ками от фурната. Този опит не е задържан във фурната за по-дълго, отколкото е необходимо, се казва в присъствието на лека мътилка (частично хемолиза) в пета епруветката - това е само половината-усмихнати работна доза от допълнение и пълна хемолиза с правилната форма на експеримента не може да бъде.

Хемолиза в контролен серум антиген (флакони 2 и 3) показват, че дози от тях са избрани правилно и, че сами по себе си или серум, или антиген допълнение не са задължителни.

В системата за контрол на хемолитична (пътека 4), с правилното му функциониране, не трябва да бъде още по-хемолиза - като няма допълват.

Уверете се, че проверките са били взети предвид, можете да се наслаждавате. Липсата на хемолиза в тръби опит разглежда като положителен Риа-ТА. Той предполага, че серумът има антитела, специфични за антигена взети. Създадена от комплекс свързан допълнение и възпроизвеждане pyatstvoval участието си в реакцията на хемолиза. Когато възникне хемолиза, резултат на реакцията се оценява като отрицателна в епруветките. В този случай, няма никаква връзка между антигени и антитела, допълнение не е свързан и участва в реакцията на хемолиза.

Едновременно с серуми пациент получава същия опит с известен положителен серум (т. Е. серум, който има антитяло към антигена) и известен отрицателен, в които няма специфични антитела. С подходящо формулиране на експеримента в първия случай да хемолиза забавяне във втория случай ще хемолиза.

Интензитетът на реакцията се изрази както следва:

+ + + + цялостното забавяне хемолиза. Еритроцитите Obra-образува равномерен мътност или утаи на дъното. В този случай, течността в тръбата стана безцветен;

+ + + приблизително 25% от лизирани еритроцити. Утайката е по-малко течност леко розово върху него. Резултати RAC също оцени колко много положителен;

+ + приблизително 50% от лизирани еритроцити. Утайката е малък, розова течност. Положителният резултат RSK;

+ приблизително 75% от лизирани еритроцити. Мала-Ing остатък интензивно оцветени евреите кост над него. Съмнителни резултати RSK;

- всички лизирани червени кръвни клетки. Течен интензивно оцветени и кристално чист. Отрицателният резултат от повторното RAC.