диагностика на вируси

техники за отглеждане на вируса

За растежа на клетъчни култури с помощта на захранващото цялата среда комплекс състав, съдържащ енергийни източници, минерали, аминокиселини, витамини и други

растежни фактори. Клетките са изключително чувствителни към рН на промяна-niju. За контрол на рН, се добавят към средата на дисплея. Най-клетка. култури растат като монослоеве (Plas-он, състояща се от един слой клетки), здраво прикрепени към повърхността на съда за култивиране - тръби, пластмасови плоча или матрак) (флакон 4 едностранно ние VOR). Някои видове клетки, способни да растат в подозрителна-Сион.

Получаване първичен kultty клетки включва не-много последователни етапи: раздробяване тъканта, конектор-съюз клетки чрез tripspozitsii прането Получената хомогенна суспензия от единични клетки от трипсин, последвано от суспендиране на клетки в хранителна среда, осигуряване на растежа им (например, 199 среда, допълнена с телешки серум) , Когато утаяване на клетките, а здраво закрепена към стената на тръбите или бутилки, които са разпределени в монослой. След получаване на жизнеспособни култура монослойни клетки са заразени с неговите мате-риала, съдържащи вируси. ОПП-горе-микроби проникват в клетките, където тя ще се размножават, те. В клетъчни култури успяват да обработват повечето от вирусите, които причиняват болести при човека.

Вътреклетъчните паразити имат дей цитопатичен действие (СРЕ) на клетките, което се случва в тяхното размножаване. СРЕ може да се прояви унищожение (лизис) на инфектирани клетки, промени в морфологията (промяна на размера и формата на клетката, появата на вакуоли и включвания, които представляват вътреклетъчни вируси натрупвания образуват oschtsitiya) и нарушение на техните функции.

Пилешки ембриони. ембриони Пилешки сравнение с клетъчни култури са много по-малко замърсени с вируси, а също така имат сравнително висока, но жизненост и устойчивост на различни влияния. Те са подходящи dlyanekotoryh вируси, които са патогенни за човека.

За получаване на чисти култури от Rickettsia, Chlamydia и брой на вируси за диагностични цели, както и. също така за получаване на различни формулировки (ваксини, Diagnostica) ispol'uet, образуват 8-12-дневни ембриони пиле. danno недостатъците ти техника включва невъзможността за откриване на тестовия микроорганизъм без предварително дисекция на ембриона, и наличието на голям брой протеини и други отлагания на свързан усложнява последващо пречистване на агент за производството на различни preparator

За да зарази пилешки ембрион тестов материал се въвежда в Аланто и амниотичната кухини по-залепващи алантоичната мембрани или в жълтъчната торбичка на пилешки ембрион (фиг.). За инфекцията в алантоисно в корпуса през въздушната камера (граници на своята предварително obvo DYT молив на просветляване яйца), не се прави не голям отвор с ножици, скалпел или спе-циален свределче. С помощта на спринцовка инжектира 0,1-0,2 мл вирус-съдържащ материал до дълбочина от 2-3 мм под границата проветриво солна камера. Отворът в корпуса е изпълнен с стопения парафин. Аутопсия инфектирани ембриони, получени по отношение на максимално натрупване на вирус (48-72 часа ин-kubatsii при 37 ° С). След лечение с алкохол и 2% разтвор на йод обвивка дисекция с ножици малко над очертани граници солна молив-въздушна камера, накланяне на яйцето, така че да се избегне падане в кухината на обвивката. Shell отстранява внимателно отстраняване на ножницата и това се разтваря Chorio-алантоична обвивка около мястото на инфекцията, по mechaya присъствие или отсъствие на лезии -. Кръвоизлив, плаки и т.н. След Pasteur пипета Pierce Chorio-алантоична обвивка в областта без кръвоносни съдове и алантоична течност се аспирира. След възстановяване хо Rion-алантоична мембрана, тя се промива два пъти с изо-тоничен разтвор кал разтвор на натриев хлорид, се поставя в блюдо на Петри и се отбелязва върху черен фон присъствие на специфични лезии.

Лабораторни животни. Видове, възприемчиви животни, тяхната репродуктивна възраст определят начин Нес вирусите. В много случаи, единственото новородено Ms-votnye чувствителен към определен вирус (като мишки сукалчета на вируса на коксаки). Предимството на метода на отглеждане на облигатни вътреклетъчни паразити в или в контролирани условия при лабораторни животни над другата е селекция от тези вируси, които са слабо-reprodutsi ruyutsya в клетъчна култура или ембрион количка-Moznosti. Нейните недостатъци включват висока степен на вероятност от замърсяване на тялото при животните dopytnyh чужди вируси, микоплазми, и необходимостта от последващо замърсяване на културата лепило-ток, за да се получи чиста култура на вируса, че Уве-lichivaet изследователски условия.

вируси показване методи. За да се докаже наличието на по-вирус в клетъчна култура, използвайки няколко метода.

I. На репродукцията (възпроизвеждане) на вируси в клетъчна култура се съди по tsitopatteskomu ефект (СРЕ), който може да бъде открит чрез микроскопско морфологичен на Menen клетки.

а) Някои от тези клетки са убити и отлепи от стените на тръбата. б) вирусни частици, освободени по време на разрушаването на някои клетки, заразени с друг, което след известно време да загинат. В резултат, вместо напълно крак монослоя клетки са само на няколко kletoch Най острови.

Герой CPE, причинени от различни вируси, не е същото. При възпроизвеждането на някои вируси (paramiksoviru-Si, херпесни вируси), наблюдавана клетъчно сливане за образуване на синцитий, други (ентеровируси, реовируси) - бръчки и унищожаване на клетки, трета (аденовирус) - агрегация на клетки. вирус СРЕ е оценена в динамика, грижа култура на клетки под микроскоп, по различно време след инфекция на вирус-съдържащ материал. Не-, че вируси (ентеровируси, херпес вируси) причина CPE за 1-2 дни, а други - по-късна дата (4 ^ -6-ти ден). CPD символи се използва за откриване на вируси (дисплей) и показателни за идентификация, т.е. оп-определеност на техните видове.

Някои вируси могат да бъдат открити и идентифицирани от включвания, че те образуват в ядрото или цитоплазмата на инфектираните клетки. Различна форма включвания и диапазона на размера от 0.25 до 25 микрона. Те са вирусните частици, места, където и могат да бъдат идентифицирани чрез препаративна минути получава от инфектирана тъкан и се оцветяват с флуорохроми. В последния случай, че се използва флуоресцентна микроскопия.

За замърсени проучвания морфологията на клетките да използват специален обърнат микроскоп, в сътрудничество torogo осветител е на върха, и лещи - от дъното на сцената. С такова устройство е възможно да се направи оценка на морфологията на клетките, нарастващи като монослой на повърхността на съда за култивиране. Kie морфологични промени в клетките се открива от цис-микроскопски използват придържане култура леща 8x или 40х. При сравняване на клетъчния монослой, заразени с вируса на неинфектирани клетки в контролната проба има пълна или островчета резервоар разрушаване на клетките или други промени, които характеризират вирус CPE на. За по-подробно изследване на СРЕ в контейнера за култура се поставя покривно стъкло върху който се формира монослой. След това стъклото се отстранява, инфектираните клетки се фиксират и подготвени микроскопско лекарство, които са флуорохром-оцветяване и т.н.), и проучване метода на потапяне.

вирус СРЕ може да се демонстрира чрез "цвят проба": метаболитно активни клетки в културата на живот отделят кисели храни, може свързва, промяна на цвета на индикатора присъства в културалната среда. Когато възпроизвеждането на вирусните клетки губят способността си да метаболизира и умират, така оцветяване среда не се променя с течение на времето.

II. gemadsorbtsii на реакцията се използва за указване GEMAG-glyutiniruyuschih вируси. Реакцията се основава на способността на клетъчната повърхност, които са възпроизведени такива вируси адсорбират еритроцити. За да се активира gemad реакция сорбция на култура от клетки, инфектирани с вируси, се прибавя еритроцити суспензия и след известно време контакт millstands-ки промиват с изотоничен разтвор на натриев хлорид. На повърхността на клетките, заразени с вируси останат залепнали-Chiyah еритроцитите.

III.Reaktsiyu хемаглутинацията (DSA) се използва за obna-servation хемаглутиниращи вируси в културална течност или инфектирани клетки култура или околоплодна течност хориоалантоинова пилешки ембриони. Хемаглутинация - "свързване" на червени кръвни клетки от различни видове животни (пилета, гъски, морски свинчета) -, причинена от вирус, съдържащ хемаглутинин vobolochke. За определяне на реакцията gemagglyuti-нация на изпитвания материал прибавя към суспензия от червените кръвни клетки. При наличие на вируси аглутинира еритроцитите.

3 и т.н. За титър на Niemann-WGA при максимално разреждане при която се наблюдава хемаглутинацията (++). Titer DSA описва активността на вируса и се използва в състава на HI.

За количествено откриване на вирусни частици се-polzujut методи титруване. Вирусният титър може да се определи в хемаглутинацията с разреждания 10-кратни задънена положително цяло число среда или материал на пилешки ембрион, или чрез СРЕ в клетъчна култура. В последния случай, клетките на културата се заразяват с 10-кратни разреждания на материал, съдържащ вирус. След 6-7 дни инкубация на сърфиране за наличие на CPE. За вирусен титър, като най-високото разреждане, което причинява CPE в 50% от заразените задънена кръг. Вирусният титър се изразява количество цитопатичен (инфекциозни) дози (ID5 на)

-По-точно отчитане количествен метод Nym отдел-TION на вирусни частици е метод Xia плаки. клетъчна култура се инокулира с вирус, и капак тон Kim слой от агар. След по-kubirovaniya култури в Techa настроени за няколко дни в агар части от повърхността се появи просвети възпиране разделена форма (плаки) са области на мъртвите клетки в монослойна клетъчна култура напълно-префектура. Всяка плака се образува чрез умножение на VEE-диференцирани частиците и се вижда ясно като кръгло сечение светлина върху червен фон на клетки, оцветени с неутрално червено ин виво. Тигърът на вируса, този набор-IU Тод, изразява броя на образуващите плочки единици (PFU) в 1 мл. Размер, морфология и времето на плаки Различни chayut-не само в различни видове вируси, но също така и от отделните щамове от същия вид. Тези знаци се използват за подбор на щамове и подготовката на така наречените чисти-Mykh вируси линии.