Щам Staphylococcus Hominis KLP-1 - получаване на ниско тегло пептидни съединения, които инхибират молекулни

Щам Staphylococcus Hominis KLP-1 се изолира от клинични проби по време на скрининг за коагулаза-отрицателни стафилококи щамове способността да произвежда с ниско молекулно тегло антимикробни пептиди. Щам е бил депозиран при събирането им GNIISKMPB. Tarasevich номерирани 284. Когато се култивират в течна среда щама се характеризира с повишен добив на ниско молекулно тегло пептидни антибактериални съединения, които инхибират растежа на грам-положителни бактерии. Антибактериалният ефект се проявява срещу бактерии от следните родове: Arthrobacter, Bacillus, Enterococcus, Micrococcus, Mycobacterium, Rhodococcus, Staphylococcus, Streptococcus. Добив антибактериални пептиди с ниско молекулно тегло е 1024000 ЕПЕ в 1 L среда. 1-ил. Таблица 1.

Данните за България патент 2428470

Изобретението се отнася до областта на биотехнологиите, медицинска микробиология и микробиологичен промишленост и се отнася до щам Staphylococcus производство Hominis KLP-1, производство ниско тегло пептидни съединения молекулни които инхибират развитието на грам-положителни микроорганизми.

течност култура се открива Staphylococcus Hominis KLP-1 антибактериална активност, по-голямата Staphylococcus Epidermidis 33 развитието и други грам-положителни бактерии. Установено е, че антибактериалната активност се дължи на наличието на два пептиди с ниско молекулно тегло, които не изискват синергично допълват взаимно за активност. Въпреки това, антибактериалната активност на комбинираното действие на пептидите значително увеличава.

Изолиране на антибактериални съединения е добре известна функция на някои видове Staphylococcus SPP.

В литературата е описано щамове на Staphylococcus, които могат да представляват интерес за биотехнологична продукция на антимикробни пептиди в търговски цели.

Известен S. Epidermidis щам 5, секретиращи малка молекула пептид съединение Pep 5, спектърът на антибактериална активност, която е ограничена от членове на други видове от рода Staphylococcus и някои видове от рода Micrococcus (Sahl HG и Brandis H. Начин на действие на staphylococcin-подобен пептид Pep5 и условия на култивиране извършване неговата дейност. Zentralbl. Bacteriol. Mikrobiol. Hyg. 1982 V.252, № 2. P.166-175).

По този начин, тези известни щамове имат относително тесен спектър на антимикробно действие.

Проблемът трябва да бъде решен от претендираното изобретение е да осигури нов щам на микроорганизми-производители на високо активни пептидни съединения с ниско молекулно тегло широк спектър на антибактериално действие.

Техническият резултат на което може да се получи от практиката на изобретението е повишен добив на заглавното съединение високо активна широк спектър на антибактериална активност при култивиране получаване на богата среда.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО - щам Staphylococcus Hominis KLP-1 секретиращ когато се култивират в течна хранителна среда, повишени количества ниско молекулно тегло пептидни антибактериални съединения, които инхибират растежа на грам-положителни микроорганизми от различни родове и семейства.

Щам е бил депозиран при събирането на Държавния изследователски институт по стандартизация и контрол на медицински биологични препарати. L.A.Tarasevicha под номер 284, както с ниско молекулно тегло антимикробни пептиди, които произвеждат широк спектър на действие, различен от известни щамове, значително по-високи нива на производство на тези съединения в една партида култивиране.

Растежът на агар-агар.

Когато посяване с наклон инсулт расте под формата на гладка остриета кръгъл с гладки млечно бели колонии с размер при аеробни условия при 37 ° С след 24 часа е 1.2-1.5 мм, след 48 часа 1,7-1, 9 mm и 72 mm 2.0-2.2 часа. Колонии, могат лесно да бъдат отстранени от повърхността на агар микробиологичен линия.

Растежът в течна среда.

Когато инокулиране течна хранителна среда при условия на разбъркване опит бърз растеж под формата на хомогенна суспензия, която при стоене бактериални клетки равномерно се утаи на дъното на съда и да се премести лесно ресуспендират с разклащане. Оптичната плътност на хомогенна течност една нощ култура се отглежда в 250 мл колби с 50 мл среда при 37 ° С в термостатна клатачка Certomat ( «Sartorius», Германия) при 150 оборота / минута достигне 2.7-3.2 (детектор - PD-303 спектрофотометър, 600 нанометра дължина на вълната, кювета с оптичен път дължина 10 mm). На всички носители в присъствието на 10-15% NaCl вижда бърз растеж.

Клетките се лизират бързо под влияние на lysostaphin, но нечувствителни към лизозим действие.

Oksidazootritsatelny. Формиране киселина в окислението аеробно захароза, малтоза, трехалоза, лактоза, галактоза и фруктоза.

Нитрат редуктаза не образува ацетоин, не предизвикват хемолиза и не е коагулиран заешки серум; Те не разполагат с алкална фосфатаза, чувствителни към Новобиоцин.

Продуктът се синтезира от щам на:

Антибактериалният ефект на културалната супернатанта Staphylococcus Hominis KLP-1 проявява когато направи в среда бактериалния растеж S. Epidermidis 33. Инхибиторна активност запазва след 60 мин кипи супернатанти. Лечение на супернатанти нуклеаза - ДНК-аза РНК-аза няма ефект върху тяхната антибактериален ефект. След протеолиза с трипсин, пепсин и протеиназа К антибактериална активност в супернатантите на културата на производителя изчезва напълно. Когато ултрафилтрация в Centricon-3 система (3 Ша «Amicon") антибактериална активност на препаратите напълно открит в ултрафилтрата. Фактите потвърждават пептид естеството на фактор с молекулно тегло по-малко от 3000 Da.

Метод за определяне на антибиотична активност в културалните супернатанти Staphylococcus Hominis KLP-1:

Определяне на антибактериалната активност в аликвотни части от културалната среда се осъществява в имунологични плаки като се използва принципа на двукратни разреждания на аликвотни части от растежната среда. Ямките на плаката бяха добавени 100 uL от течна среда MN. В първото гнездо в ред 100 мкл на теста супернатантата, стерилизира чрез варене във водна баня за 10 минути. Чрез последователно прехвърляне на 100 л на съдържанието на първите гнезда на ред в следващите двукратни серийни разреждания бяха получени от 1: 2 до 1: 4096. След това във всяка ямка се прибавят 10 мкл суспензия на тест-култура на S. Epidermidis клетки 33, съдържащи 10 юни CFU / мл. Ефикасността е оценена от инхибиране на действието на 16-18 часа на инкубиране на плочите при 37 ° С За конвенционална единица антибактериална активност на фактори като реципрочната стойност на максималното разреждане, при което не е пълно инхибиране на растежа на бактериите от изпитването и са изразени по отношение на неговата активност (ЕА) / мл.

Условията на процеса и състава на среда за съхранение на щама: В MN лабораторната щам съхранява на наклон агар след засяването линия течен инокулат. Презасяване на чист MH агар се провежда на всеки 3 месеца.

За лиофилизирани клетки на щама в захароза желатин агар се използва като криопротектор, съдържащ 10% захароза, 1.5% желатин и 0,1% агар. Изследване на производството на антибактериално пептид след лиофилизация щам показва пълно задържане на тази функция, когато се отглежда в течна среда.

Питейна фаг: бактерии от чувствителността на щама към фаги беше изследвано в бранша федерална държава Единична Enterprise "Microgen" НСО "Biomed" (Perm). Щам S. Hominis KLP-1 лизирани типичен фаг I, II, III, V и групи vnegruppovymi фаги, както и специфичен бактериофаг в титър от 10 -3 метод Gracia.

Генетични характеристики: antibiotikochuvstvitelnosti щам изследвани конвенционален метод като се използва стандартен диск, съдържащ различен механизъм на действие антибиотици. Отчитане на инхибиране на растежа на бактериални зони тревата се извършва след 18 часа.

Средният диаметър на инхибиране на зона в мм:

Ампицилин - 15; оксацилин - 18; Гентамицин - 9; хлорамфеникол - 10; линкомицин - 32; рифампицин - 36; тетрациклин - 16; fuzidin - 28; еритромицин - 10; цефалексин - 23; ципрофлоксацин - 26; Vancomycin - 18.

Възможността за използване на изобретението е илюстрирано с примери, които не ограничават обхвата и духа на претенциите, свързани с него.

Антибактериално действие на супернатанти от културалната среда Staphylococcus Hominis KLP-1 е показано в Таблица 1.

По този начин, в резултат щам продуцент е ниско тегло пептидни съединения молекулни които проявяват антибактериална активност срещу широк спектър от грам-положителни микроорганизми. Щамът се характеризира с високо ниво на производство на тези съединения достига 1024000 ЕПЕ в 1 литър среда, когато се култивират в течна хранителна среда.

ПРЕТЕНЦИИ

Щамът на Staphylococcus Hominis KLP-1, депозиран при събирането им GNIISKMPB. Tarasevich номерирани 284, - получаване на ниски тегло пептидни съединения молекулни които инхибират развитието на Грам-положителни бактерии.

Патенти в клас България C12P21 / 00: