Щам на бактерии Acinetobacter calcoaceticus - производство ендонуклеаза признава и

Употреба: микробиология и биотехнологии. Същност на изобретението: откриване производство Acinetobacter calcoaceticus щам VKPM В-6337, и осигурява непатогенен рестрикционен ензим разпознава и разцепва нуклеотидната последователност 5 -GGTACC-3. с висок добив и активността на ензима. Добив ензим е 60 000 единици / г влажна биомаса, специфичната активност на целевия ензим е 10 000 - 100 000 U / мл. Ограничаване ензим Acc 651 е изосхизомер рестриктазата Kpn 1 и може да замести последния във всички генно инженерство работа. 1-ил.

Изобретението се отнася до микробиологична промишленост и генното инженерство и се отнася до получаване на нов щам произвежда ендонуклеаза сайт-специфична способни да разпознават и отцепване последователност от нуклеотиди, 5'-GGTACC-3 '.

Рестрикционен ензим, като специфичност може да се използва за проучване на първичната структура на ДНК, различни физически картографиране на геноми. Това ендонуклеаза е удобен модел за изследване на специфичността на взаимодействието протеин-нуклеинова киселина.

Известен щам Acinetobacter calcoaceticus, производство на рестрикционен ензим AccI, AccII и AccIII (места за разпознаване 5'-GTMKAC-3 ', 5'-CGCG-3' и 5'-TCCGGA-3 ', съответно) [1] Недостатък на този щам е в биомаса, които са три ограничение ензим. Това усложнява процедурата на пречистване, и нито един от рестрикционния ензим не е в състояние да разпознава и да се залепи нуклеотидната последователност 5'-GGTACC-3 '.

Известен щам Achromobacter species718, производство рестрикционна ендонуклеаза разпознава и разцепва нуклеотидната последователност 5'-GGTACC-3 '[2] Недостатъците на този щам е висока продължителност на култивиране (10 часа), добивът на биомаса е 0,2 г / л. С унищожаването на биомасата се използва специално оборудване (френска преса).

Най-близкото ниво на техниката към съгласно щам е щам на Klebsiella пневмония, производство на рестрикционен ензим Kpn I [3] Този щам произвежда един рестрикционна ендонуклеаза разпознава и разцепва нуклеотидната последователност 5'-GGTACC-3 '. Добив ензим е 50,000 единици / г влажна биомаса.

Основният недостатък на този щам е неговата патогенност. В микроб е жител на лигавицата на дихателните пътища. Може да причини пневмония, гнойни процеси, цистит. При получаване на биомасата е необходимо да се спазват специални правила за безопасност.

Задача на изобретението е да се получи щам получаване на рестрикционен ензим разпознава и разцепва нуклеотидната последователност 5'-GGTACC-3 ', с висок добив на ензим, който не изисква специални условия за получаване на биомаса, която не е патогенен за хора.

Целта се постига чрез идентифициране и използване на щам от Acinetobacter calcoaceticus производство на сайт-специфична рестрикционен ензим Acc65 I.

Щамът изолиран от производителите в търсене на рестрикционни ендонуклеази.

Полученият щам е Acinetobacter calcoaceticus непатогенен и депозиран в VKPM Genetics изследователски институт под номер за достъп В-6337, произвеждан и ги име рестрикционен ензим Acc65 I съгласно обща номенклатура.

Щамът от Acinetobacter calcoaceticus се характеризира със следните особености.

Клетките прътовидния, прави и дебелина (1.0-1.5 х 1,5-2,5 цт) в логаритмична фаза на растеж и почти coccal в болница. Благоприятно, понякога по двойки в веригите. Не се образува ендоспори и камшичета. Оцветяване по Грам грам-отрицателни.

Напрежението не е взискателен към растежни фактори, расте добре и на обикновени хранителни среди (SPA, MPA, МРВ). В агарова среда форми малки, кръгли, без пигментирани колонии блестящи, с плавен ръб.

Оптимална температура растеж 30 ° С, рН 7,0-7,2.

Презасяване култура се поддържа на твърда среда, се съхранява в разтвор на глицерол при 70 ° С или лиофилизиран състояние.

Отрицателна в Voges-Proskauer реакция; индол и не образува Н2 S; katalazopolozhitelen; oksidazootritsatelen. Форми киселина от глюкоза не се наблюдава анаеробен растеж в агар; устойчиви на пеницилин.

За култивирането на Acinetobacter calcoaceticus използва среда със следния състав, г / л пептон 10; дрожден екстракт 5; глюкоза 5; Дестилирана вода почивка. Култивирането се провежда при 30 ° С и интензивно аерация за постигане фаза забавяне на растежа на.

Добивът от 60000 ензимни единици / г влажна биомаса със специфична активност 10.000-100.000 U / мл.

Определяне на разликите между предложен щам на щама на прототипа са: непатогенен, високата производителност на щама; висока активност на ензима; Тъй като предложената щам е първият получен и да подчертае рестрикционен ензим като мястото за разпознаване 5'-GGTACC-3 ', никога не е била използвана, е възможно да се заключи, че щамът на настоящото изобретение, критериите "ново" и "изобретението ниво".

Чертежът е ДНК electrophoretogram хидролизни продукти на ламбда фаг ензим Acc65I (dor.1), Acc65I и KpnI (dor.2), KpnI (dor.3).

Идентичността на ленти разцепване паралелно и едновременно хидролиза izoshizometriyu ги потвърждава.

ПРИМЕРИ Пример 1 Получаване на биомасата и възстановяване на ензима.

Преди да започнете, от щама пасира клетки бактериологично контур на агар-агар. Блюдото на Петри се поставя в термостат при 30 ° С След 10-12 часа инкубация на отгледани клетки преминават в колби със свежа среда на растеж, състоящи се от (г / л), пептон 10, екстракт от мая (Difco) 5, 5 глюкоза, дестилирана вода остатъци , Култивирането се провежда при 30 ° С с аериране на 1.5 обем / мин, разбъркване 250 об / мин, за увеличаване на фазата на намаляване на скоростта (3-5 часа). Клетките се събират чрез центрофугиране при 1500 грама при температура 1 ° С разпадане, разделяне и пречистване се извършва в съответствие с процедурата на Bickle, Pirotta, Imber [4] Пример Пример 2 Определяне на активност и ензимни специфичност.

Специфичността на ензима се определя от конфигурацията на паралелен и ко-субстрат хидролизиране на ДНК. Идентичността на хидролиза на картини на 1-3 парчета предполага, че тези ензими разпознават и разцепват същата последователност от нуклеотиди, 5'-GGTACC-3 '.

Ензим Добив Acc65I определя чрез електрофореза картина хидролиза на ламбда фаг ДНК. Една единица активност се определя минималното количество ензим, необходимо за пълно разграждане 1 мкг ламбда фаг ДНК за 1 час при 37 ° С. Добивът на ензима е 60,000 единици / г влажна биомаса, специфичната активност на 100 000 единици / мл.

Ензимът се съхранява при 20 ° С в глицерин.

Така полученият щам, има следните предимства в сравнение с известните: непатогенен, висока производителност щам;
висока активност на ензима;
Тъй като ензим ограничение Acc65 аз има сайт за разпознаване на 5'-GGTACC-3 ", е идентичен с място за разпознаване на ограничителен ензим Крп, той може да бъде заменен във всички прототип генетично строителство.

Бактериите Acinetobacter calcoaceticus щам VKPM B-6337 производство на рестрикционна ендонуклеаза разпознава и разцепва нуклеотидната последователност 5 -GGTACC-3.