рекомбинантни протеини

Обобщение на биотехнологиите

"Рекомбинантни протеини (свойства плазмидна препарат)"

Генното инженерство на конкретна и точна характеристика на клетъчни обекти и работи главно с различни форми и размери на клетъчни фрагменти. ТЕРМО "генно инженерство", "генно инженерство" и "рекомбинантна ДНК" - еквивалент [3].

Генното инженерство може да бъде представен като съединение на ДНК фрагменти от естествен и синтетичен произход или комбинация от ин витро, последвано от въвеждане на получените рекомбинантни структури в жива клетка, така че ДНК фрагмента добавя след включване в хромозомата или реплицира или експресира самостоятелно.

Най-вече в производството на рекомбинантни протеини е да реши проблема с недостига на суровини, тъй като от човешка тъкан в търговски мащаб, че е невъзможно да ги вземем.

Както производство на рекомбинантни човешки протеини най-често използваните понастоящем: E.coli (Escherichia Coli), Bacillus Subtilis (сенна Bacillus), Saccharomyces Cerevisiae (хлебна мая).

Тези организми са безопасни достатъчно, но все в околната среда не са желателни по няколко причини. В тази връзка, там е приет и следвайте внимателно правилата на работа с рекомбинантите.

Трябва да се отбележи сигурност на генетично и физическо ниво и се отнася до производството на някоя от рекомбинантни протеини.

1. Методи на генното инженерство при получаването на рекомбинантни протеини

Генното инженерство - Design функционално активен ин витро генетични структури (рекомбинантен ДНК), или друг - създаване на изкуствени генетични програми (Баев АА). Чрез ES Piruzyan генното инженерство - техники експериментална система, като позволява дизайн лаборатория (ин витро) генетични изкуствени структури във формата на така наречените хибридни или рекомбинантни ДНК молекули.

Генното инженерство - получаване на нови комбинации от генетичен материал се извършва чрез манипулиране на клетки с молекули на нуклеинова киселина и за генен трансфер, създадени структури в жив организъм, в който се постига чрез включването им и активност в този организъм и неговото потомство. Тя е за посоката, в предварително определена програма дизайн на молекулярно-генетични системи извън тялото, последвано от въвеждане на живото тяло. Където рекомбинантната ДНК се превръща в неразделна част от генетичния апарат retsepientnogo тялото и съобщава себе си нови и уникални генетични, биохимични, и след това физиологични свойства.

Приложението цел на генното инженерство е да се построят такива рекомбинантни ДНК молекули, които, когато са включени в генетичния апарат прикрепен към свойствата на тялото полезни за човека. Например, получаването на "биологични реактори" - микроорганизми, растения и животни, фармакологично важни вещества за човека, създаващи сортове растения и видове животни с ценна определен за човешки черти. Генетични инженерни методи позволяват генетичен сертифициране, за диагностициране на генетични заболявания, за създаване на ДНК ваксина за провеждане на генна терапия на различни заболявания [1].

Рекомбинантна ДНК технология използва следните методи:

- специфично разцепване на ДНК с рестрикционни нуклеази ускоряване избор и манипулация на отделни гени;

- бърза последователност от нуклеотиди, пречистени ДНК фрагмент, който дава възможност да се определят границите на гена и аминокиселинната последователност, кодирана от нея;

- конструиране на рекомбинантна ДНК;

- хибридизация на нуклеинова киселина, която дава възможност за откриване на специфични последователности на РНК или ДНК с по-голяма точност и чувствителност на базата на тяхната способност да се свързват с комплементарни последователности на нуклеинова киселина;

- DNA Cloning: ин витро амплификация се използва полимеразна верижна реакция или въвеждането на ДНК фрагмент в бактериалната клетка, които след трансформация произвежда фрагмент в милиони копия;

- въвеждането на рекомбинантна ДНК в клетките или организмите.

Конструиране на рекомбинантни молекули с помощта на редица ензими - особено рестрикционни ензими. Понастоящем се използва повече от 400 различни рестрикционни ензими. Тези ензими са синтезирани различни микроорганизми [5].

Рестрикционни ензими разпознава и разцепи специфични нуклеотидни последователности в двойно-верижна ДНК молекула. Въпреки това, някои рестрикционни ензими с молекулно клониране недостатъчно, тъй като водородните връзки между четирите бази, които образуват лепливи краища, които не са толкова силни, за да държи обединени две ДНК фрагменти.

Един от рекомбинантната ДНК молекула носи гена, който се очаква да бъде клониран, а другият - съдържа информацията, необходима за репликацията в клетката на рекомбинантна ДНК.

2. плазмиди. Концепция и видове плазмиди

Най-разпространеният метод е метод на генното инженерство рекомбинантен (съдържаща чужд ген) плазмиди, които са кръгли, двойно-верижна ДНК молекула, състояща се от множество от двойки нуклеотиди, и способни на автономна репликация [4].

За плазмиди, характеризиращи се с стабилно съществуване в не-хромозомна състояние в бактерии. Всяка бактерия в допълнение към основните, не напусне клетката на ДНК молекули (5 х 106 базови двойки) може да съдържа няколко различни плазмиди която комуникира с други бактерии.

Плазмидите, вариращи по размер от няколко хиляди до стотици хиляди базови двойки и броя копия на клетка - от един до няколко стотици, са способни самостоятелно (независима от основната хромозомата) репликация и стабилно наследени в редица клетъчни поколения.

Въпреки че много от получаване клетки гостоприемници плазмид материални селективни предимства (резистентност към антибиотици, тежки метали, и т.н.), повечето от тях са загадъчен, т.е. не проявява в клетъчния фенотип.

Началото на репликация ColE1 малък плазмид, носещ гени на резистентност към колицин конвенционално използвани в генното инженерство в изграждането на вектор ДНК молекули, които се използват за клониране и експресиране в Е. Coli клетки, къси нуклеотидни последователности.

Плазмидите са намерени в много бактерии, принадлежащи към различни таксономични групи. Количеството на плазмидна ДНК в клетката обикновено не е повече от няколко процента на клетъчната геном, и на броя на плазмиди варира от 1 до 38. Плазмидите - линейна или ковалентно затворена кръгова ДНК молекула, съдържаща от 1,500 до 40,000 базови двойки. Повечето плазмиди се състоят от три групи от гени: региона на ДНК отговорен за автономна репликация на плазмида в клетката; генна система, позволяваща трансфер плазмиди от една клетка към друга; гени, които определят свойствата, които са полезни за клетките гостоприемници. Отличителна черта на плазмиди - автономна репликация способност, следователно, минималният размер на ДНК, която може да се нарече плазмид - е фрагмент, който осигурява за автономна репликация на плазмид DNA в клетката като цяло.

Обикновено наличието на плазмиди в бактериална клетка се оценява от появата на някои симптоми, които включват резистентност към някои лекарства, способността за прехвърляне на гени при конюгация, синтеза на антибиотични вещества в природата, способността да се използват някои разграждане захар или да осигури редица вещества.

Повечето бактериални плазмиди има способността самостоятелно да се реплицират има несъвместимост фактор и трансфер фактор. Плазмидите носят множество специфични, определени всеки плазмид маркери: антибиотична резистентност, тежки черни материали, ултравиолетова радиация, способност за биосинтезата на токсини.

Както векторите могат да бъдат използвани opuholeobrazuyuschie бактериален плазмид. видове Agrobacterium на еволюционно свързани възлите бактерии, принадлежащи към род Rhizobium и имат много общи черти с тях. Въпреки това, естеството на взаимодействието с Agrobacterium растението има специфични характеристики [6].

Взаимодействие вида Agrobacterium за растенията е от особен интерес, тъй като при този тип паразитизъм един партньор специално променя свойствата на гостоприемника чрез вмъкване на техните гени в своя геном. В допълнение, той служи за уникален пример на прокариотна ДНК миграция в еукариотна клетка. Митохондриите и хлоропласти съдържат пълната генетична система, т.е. всички компоненти, необходими за експресията на генетичната информация: ДНК, ДНК полимераза, РНК полимераза и машината протеин-синтезиране (рибозоми, тРНК, аминоацил-тРНК синтетаза).

3. Получаване на плазмиди

Най-разпространеният метод е метод на генното инженерство рекомбинантен след estsoderzhaschih чужди генни плазмиди.

Всяка бактерия в допълнение към основните, не напусне клетката на ДНК молекули (5-6 милион. Базови двойки), може да съдържа няколко различни плазмиди която комуникира с други бактерии.

Плазмидите са автономни генетични елементи реплициращи (т.е. умножаване) в бактериалната клетка не е в същото време, че основната ДНК молекула. Въпреки плазмиди съставлява само една малка част от ДНК на клетката, те са такива, от съществено значение за бактериални гени, гени на резистентност. Различните плазмиди съдържат различни гени на резистентност към антибиотици.

Плазмидните вектори, които са склонни да се създаде генно инженерство, така че естествено (немодифициран) плазмид серия лишен свързване "vysokokachestvennnogo вектор" свойства:

- малък размер, защото ефективността на прехвърлянето на екзогенна ДНК в плазмида E.coli намалява с дължина над 15 килобази;

- присъствието на рестрикционния сайт, който извършва вложката;

- присъствието на един или повече селективен генетичен mrkerov за идентифициране реципиентни клетки, носещи рекомбинантна ДНК.

За рекомбинантна плазмидна ДНК от плазмид се разцепва с избран рестрикционен ензим. Генът, който е необходимо да се влиза в бактериалната клетка, се разцепва от ДНК на човешки хромозоми с рестрикционен ензим, така че е "лепливи" краища са комплементарни нуклеотидни секвенции в краищата на плазмида.

Лигаза ензим "лепило" двете парчета ДНК, получени в рекомбинантен плазмид пръстен, който се въвежда в бактерия Е. коли. Всички потомци на бактерии (клонове) съдържат чужд ген плазмиди. Целият този процес се нарича клониране.

Въведена плазмида в соматични клетки чрез химични средства, които повишават пропускливостта на клетъчната мембрана. По-специално, за да се осигури проникването на плазмидна ДНК на клетките, те се третират с разтвор на ледено студен калциев хлорид, и след това се инкубират при 42 ° С в продължение на 1.5 минути. Тази обработка води до локална разрушаване на клетъчната стена. максимална честота трансформация -10-3 В, т.е., за всеки хиляда клетки, има една трансформира. преобразуването на честотата не е 100%, след това се използват схеми за избор, които позволяват да се идентифицира трансформирани клетки [2].

Като маркер плазмид може да съдържа гени, определящи резистентност в бактериите към антибиотици. Вмъкване на гена на външната (донор) маркерен ген води до инактивиране на последната. Това позволява да се направи разграничение на трансформираните клетки, които са получили вектор плазмид (загуби антибиотична резистентност), от клетки, които са получавали рекомбинантен молекула (задържана резистентност към едно, но са загубили резистентност към друг антибиотик). Тази техника се нарича обезвреждането на вложка маркер.

За селекция на трансформирани клетки, съдържащи рекомбинантна ДНК (хибриден плазмид) се тества за устойчивост към някои антибиотици. Например, клетките, приютяващи хибриден плазмид, са устойчиви на ампицилин но чувствителни към тетрациклин (в която селекционният маркерен ген и въведена донор ДНК).

Процесът на отделяне на геномна ДНК клонирани клетки и въвеждането на тези елементи в клетки гостоприемници се нарича създаване на геномна библиотека (Clone банка, в генната банка).

Всички клониране система трябва да отговаря на две основни изисквания:

присъствието на няколко места за клониране;

възможност достатъчно лесна идентификация на рекомбинантни ДНК клетки.

За всички рутинни процедури на молекулярно клониране се използва широко в E.coli като клетките гостоприемници. Клетките могат да абсорбират чужда ДНК са наречени компетентните; E.coli компетентност увеличава, с помощта на специални условия на културата. За да се получат големи количества на чужди протеини чрез рекомбинантни щамове на Е. coli плазмид беше конструиран, че съдържа силен промотор, селективен маркерен ген и кратка секция с множество уникални сайтове за рестрикционни ензими - polilenker.

Ефективните методи E.coli трансформация е електропорация с плазмиди (ефект върху клетъчните мембрани електрически ток да се увеличи тяхната пропускливост). За въвеждането на клонирани гени в соматични клетки също се използва или mikroukalyvaniya микроинжектиране и клетъчна фузия с ДНК заредени мембранни везикули (липозоми).

Без преувеличение можем да кажем, че миналото, настоящето и бъдещето на биотехнологиите въз основа на генетична интерсубспе интерспеци разнообразие от организми. Промени в нивото на развитие на науката допринася само за разширяването и условия за възникването на качествено нови начини за използване на това разнообразие.

По този начин, интензивно развитие на фундаменталните научни изследвания в областта на биологията през втората половина на ХХ век е довело до значителен напредък в тези клонове на биологията, молекулярна биология и генетика, биохимия и ензимология неврофизиологията и биофизика. Използвайки методологията на точните науки (физика, химия, математика) позволи на изследователите да характеризират различните жизнените процеси на нивото на молекулни взаимодействия. Пояснение на структурата на ДНК и РНК, процесът на генетична информация е довело до развитието на така наречената ДНК-технология, която даде възможност да се работи с отделни гени изследователи - до определени участъци от генетичен материал.

Резултатът е изключително ефективен инструмент за експериментално изследване на генетичния материал: неговата организация, функциониране и взаимодействие на различни елементи и еволюция. За някои от най-изследваните организми са генетично състояние да получи, образно казано, "рисунки" на генома.

Когато техниката изолиране на отделни гени избран условия за запазване на тяхната стабилност и определени модели на генен трансфер, съществува реална възможност за конструиране на рекомбинантна ДНК (рекомбинантна ДНК създаване буквално означава съюз (рекомбиниране) на две ДНК сегменти на различните видове) са разработени. По същество, генетичен вариант е генериран умишлено от човешката воля, и ако е необходимо, и организмите, които имат такава комбинация от гени са произведени (и съответно атрибути), които отсъстват в природата.

В момента, много експерти генното инженерство - рекомбинантни ДНК техники - са в основата на сградата на биотехнологията.

Използване на генетични инженерни техники включва насочен от предварително определена програма дизайн на молекулярно-генетични системи извън тялото, последвано от прилагане на живото тяло.

Използвайки методологията на заявената генното инженерство аспект включва изграждането на рекомбинантни ДНК молекули, които, когато са включени в генетичния апарат прикрепен към свойствата на тялото полезни за човека.

Благодарение на това реши много практически проблеми: получаване "биологичен реактор" - микроорганизми, растения и животни, които произвеждат фармакологично значение за протеинови препарати човека, създаването на високопродуктивни породи животни с определени ценни книжа за човешки черти, отстраняване на растенията, устойчиви на различни патогени и вредители и т.н. нататък. Със същата високите технологии и генетични технологии свързани сертифициране и диагностициране на генетични заболявания и създаването на ДНК ваксини и лечение на различни заболявания. По този начин, благоприятната ситуация в биологията е мощен тласък на развитието на съвременните биотехнологии, много важна област на практическо приложение на резултатите от фундаментални науки.

Glebov DC Генетична трансформация на соматични клетки // Методи за клетъчно култивиране. Л. Science 1988 година.

Егоров NS Самюълс VD Актуални методи за създаване на щамове на промишлени микроорганизми // биотехнологията. Vol. 2. М. Висше училище, 1988. 208 стр.

Piruzyan ES Андрианов VM Плазмид на Agrobacterium и генното инженерство на растенията. Наука, Москва, 1985. 280 стр.

Свързани новини: