Метод за инхибиране на хемолитична активност на патогенни щамове Е. коли

Изобретението се отнася до лекарство и може да се използва за потискане на хемолитична активност на патогенни щамове на E.coli. Пациентът се прилага електролитен сребърен разтвор в концентрация от 0.5-5.0 мг / л за 2-9 дни. Разтворът се използват както самостоятелно, така и едновременно с антибиотици. Методът позволява неутрализира хемолизино патогенни щамове на E.coli. Това повишава ефективността на лечението. 2 ЗП Предшестващо състояние е таблица 3.

Изобретението се отнася до лекарство, ветеринарната медицина, микробиология, и може да се използва, например, в хирургията и в селското стопанство за лечение на гнойни например хирургически инфекции и техните усложнения, причинени от микрофлора имащи хемолитична активност.

В спешността на въпроса се дължи на факта, че в момента не съществуват лекарства, които притежават antihemolytic дейност и се използват в медицинската практика, а, например, е основен фактор -gemolizin патогенен E.coli. Хемолизин-продуциращи щамове често се отличават от пациенти с инфекции на пикочния мехур, бактеремия, септицемия, менингит и почти не се откриват в нормални човешки фекални флора (2).

Способността на много щамове на E.coli, предизвика хемолиза на човека и животните, поради наличието в клетките на E.coli -gemolizina ген, кодиращ протеин токсин маса от 107 кД. Споменатите токсин може да не само лизират червени клетки, но също така и от увреждане на клетъчните мембрани имат цитопатни ефекти върху бъбреците епителни клетки, неврони, левкоцити, фибробласти, моноцити (1, 2, 5).

Хемолизин е най-широко изследван токсин (3, 7). Но все още не се разбира добре и разработени начини за намаляване на хемолитична активност и неутрализират патологичните действието на този токсин.

За редица други установени хемолизино вещества, които инхибират действието им и причинява предотвратяване на хемолитична ефект. По този начин, инхибира действието на лецитин хемолизини стрептококи от група А и Б (4), и активността на стафилококова -toksina и Ь-лизин намалява рязко ниски концентрации на фосфатидилхолин. Стафилококов делта токсин не показва хемолитични свойства на природни фосфолипиди в присъствието на (9). Според О. механизъм потискане Tsiganova фосфолипиди хемолизини е в нарушение на токсини взаимодействие с еритроцитите мембрана (8). Един от най-активните инхибитори на хемолиза е холестерол инактивиране хемолизин Yersinia Pestis, O2 -labilnyh хемолизини (9). Редица вещества предотвратява фиксиране процеси хемолизини стафилококи на прицелни клетки - това konkovalin А танин (предотвратява свързването -toksina ауреус); ганглиозиди Gti и GDTA.

Относно -gemolizina E.coli, инхибиторният ефект на хемолиза под влиянието на токсина има EDTA и някои локални анестетици (10). Тези вещества не могат да се използват широко в клиниката да блокира хемолитични реакции, тъй като имат редица странични ефекти и не означава лечение на бактериални инфекции (6).

Във връзка с откриването на вещества, които пречат на развитието на хемолитични реакции, не само ще позволи да се разработят начини за справяне с хемолитични щамове, но също така да доведе до разбирането на химическата природа, механизми на действие и взаимодействие на токсините от клетки.

Известен метод за инхибиране на хемолитична активност на E.coli, с помощта на електролитен разтвор на натриев хипохлорит (Petrosyan ЕА и др., "Въздействие на електрохимично окисляване на някои свойства на Е.коли." Scien. Rep. Proc. Tr. "Остра чревни инфекции", L. 1988 Vol. 12, стр. 57-59). Методът, приет от нас като прототип. Този метод се характеризира с това, че Е.коли след лечение с електролитен разтвор на натриев хипохлорит губи способността си да индуцира хемолиза на еритроцитите. Въпреки това, недостатъците на процеса включват факта, че самата натриев хипохлорит може да причини хемолиза на еритроцитите.

Настоящото изобретение избягва нежеланите странични ефекти на други лекарства, и повишаване на излагането на хемолитична активност на E.coli, чрез използването на сребърни електролитни разтвори с концентрация от 0.5-5.0 мг сребърен / литър.

Целите на изобретението са: офертата за получаване -gemolizina потискане активност, което е основен фактор в патогенността на Е.коли, чрез което се осигурява намаляване на усложнения, намаляване на тежестта и продължителността на лечението на гнойни хирургически процеси, причинени от Е. Coli.

Изобретението се състои в потискане на хемолитична активност на патогенни щамове на E.Coli с въвеждането на сребърни електролитни разтвори с концентрация от 0.5-5.0 мг сребърен / литър. Изложение може да се извърши в комбинация с друга терапия и лечение самостоятелно прилагане на електролитен разтвор сребро. Продължителността на лечението се определя от клиничната картина на заболяването и може да варира от 2 до 9 дни. Предвид безвредността на препарата (12) съгласно лечение указания могат да се продължи.

Процесът се провежда както следва.

Чрез бактериологично изследване определя присъствието на E.coli, като хемолитични свойства. Електролитно сребърен разтвор в концентрация от 0.5-5.0 мг / л прилага интравенозно веднъж дневно, и (или) чрез напояване рана два пъти дневно по време на лечението с антибиотик. При интравенозно приложение на електролитна сребро физиологичен разтвор в обем от 500 мл.

За доказване на автентичността на намаляване на хемолитична активност на микрофлората използват щамове на Ешерихия коли, имащи плазмид хемолиза. В настоящото изследване ние се използва плазмид PRD л / 13,1 MD /, включващ хемолитична детерминанта природен плазмид pSF200 Hly 212 клонира във вектор pBR325 (5,11). Тя имаше 8-10 пъти по-хемолитична активност от биологичен родител щам. PRDI плазмид беше въведен в E.coli щам DH1 (F, REC Al и Al, Gyr A96, тио-1, HSD 17 (rc-, MC +), SUP Е 44, REC А 1. -) (10) чрез трансформация. За растеж на щама използва месо-пептон бульон и обикновен агар, М9 среда.

Определяне на хемолитична активност се извършва по следния начин.

1. Получаване на еритроцитна суспензия: нитрат заек кръв се промива три пъти в изотоничен разтвор на натриев хлорид. Суспензията се въвежда в еритроцитите на еритроцитите буфер: 10 тМ Tris-HCl, 7.5 тМ СаСЬ 10 0,9% NaCl до концентрация от 1%.

2. една нощ култура на щама в ВСН pRD1 бяха отгледани до фазата на експоненциален растеж (OD 540 = 0.5).

3. Клетките се пелетизират култура в центрофуга при 3000. 15 минути и супернатантата, съдържаща -gemolizin се изследва метод разреждане на хемолитична активност.

4. супернатанта pRD1 / DH1 култура течност се разрежда в двукратни разреждания в бульон, след това се прибавя 1% еритроцитна суспензия. Сместа се инкубира в продължение на 1 час при 37 ° С във водна баня. Показване като контролни епруветки, съдържащи суспензия на еритроцитите без супернатанта (К) и 1/2 V като еритроцитни суспензии без супернатанта (50 К).

5. Измерване на клетъчната плътност останали еритроцити извършва спектрофотометър (OD-620 нм) (5, 7).

6. За да се определи ефекта на сребро на хемолитична активност се прилагат в допълнение електролитна сребърен разтвор в концентрация от 0.1; 0.25; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6 мг / л.

Резултатите от експериментите, използващи електролитен разтвор на сребро в концентрация 0.5 мг / л са дадени в таблица 1.

Хемолитична активност на пробите се изразява произволна хемолитична единица (HU), което се определя като последното разреждане, при което има 50% лизис на еритроцити (11).

Както се вижда от таблицата, супернатантата активност в присъствието на сребърен електролитни разтвори (начална концентрация - 0.5 мг / л), изразени като NO, е - HU 8 и се различава от контролата, където хемолитична активност е 128-256 HU. Следователно е налице рязко намаляване на способността на E.coli -gemolizina лизиране на червените кръвни клетки в присъствието на йони Ag ++. Таблица 2 показва резултатите от хемолитична активност се променя патогенни щамове на E.coli, под влияние на различни концентрации на електролитни разтвори на сребро: 0.1; 0.25; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6 мг / л.

От това можем да заключим, че електролитен разтвор на сребро е вещество, способно да предотврати лизис на еритроцити инфлуенца Е.коли, носещ хемолитична детерминанта. Механизмът на това действие не е известен, но може сребро електролитен разтвор с положителен заряд, промяна на структурата на активното -gemolizina сайт, който пречи на взаимодействието на токсина за насочване на клетъчната мембрана и образуването на канали. Човек не може да се изключи влиянието на лекарството върху мембраната на еритроцитите, което води до измерване на заряда на повърхностните структури, участващи в приемането на токсина.

Неутрализация на токсичните ефекти на електролитни експерименти разтвор -GEMOLIZINA СРЕБЪРНИ са извършени върху мишки с тегло 20-30 г са използвани две групи животни на 15 животни всяка.

Аз Series. И 5 мишки се инжектират с културалната супернатанта течност PRDI (OH1) при glyukozomineralnoy среда Mg (състав в г на NH4CI - 1,0; натриев хлорид - 0,5; NaHPO - 6,0; KHPO - 3,0; магнезиев - 0,2 глюкоза 4.0; дестилирана вода до 1000 рН - 7,2) - в количество от 500 микролитра интраперитонеално.

II серия. Въвеждат последователно 500 микролитра от супернатанта и 35 микролитра електролитна сребърен разтвор с концентрация 0.5 мг / л).

серия III. 500 микролитра среда М9 + 35 микролитра NaCl.

Резултатите от експериментите са дадени в таблица 3.

Както се вижда от таблица 2, електролитния разтвор на сребърен причинени повишено оцеляване на мишки, предварително третирани интраперитонеално супернатант, съдържащ -gemolizin. Това показва, че електролитни сребърни разтвори имат antigemolicheskoy активност и могат да бъдат използвани за лечение на инфекции, причинени от хемолитични щамове на Ешерихия коли.

Методът е тестван в клинични условия при 5 пациенти. Така, в един случай, електролитни разтвори на сребро се прилагат интравенозно и едновременно проведени промиване на коремната кухина.

Пример 1. пациент 62 години на процеса на тумор извършва субтотална гастректомия и проксималната резекция на панкреаса опашката. Следоперативния период се усложнява от развитието на дванадесетопръстника несъстоятелност стави, перитонит, абсцес образуване на коремната кухина и развитието на септични условия. Лечение с антибиотици, включително пеницилин, ампицилин, kefzol, tseporin, подадена ефект. Бактериологични изследвания показват подвижна коремна E.coli, като хемолитични свойства и не чувствителни към антибиотици. За здравето целеви интравенозно приложение на 500 мл електролитния разтвор на сребърен разтвор (концентрация 5 мг / л) по време на лечението с 12 Mill. U. пеницилин на ден. В рамките на два дни температурата се нормализира. Въвеждане на сребро електролитен разтвор продължава 9 дни. До 12-ия ден от състоянието на пациента е задоволително.

Пример 2. Един пациент на 65 години, страдащи от диабет, ампутация на долната част на крака след операцията в горната третина, произведени за гангрена разработен гнойни рани и септичен състояние. Засяване на раната показва присъствието на хемолитична на E.coli щам. Използването на антибиотици не произвежда положителен ефект. Целеви интравенозно приложение на 500 мл електролитния разтвор на сребърен разтвор (концентрация 0.5 мг / л). По време на 3 дни температурата се нормализира. Въведение електролитна сребърен разтвор продължава 2 дни. Едновременно с това, 2 пъти на ден, проведени рана напояване електролиза на разтвор на сребро. Състоянието на пациента се стабилизира. Раната е чиста и впоследствие Пациентът е изписан в добро състояние.

Новостта на метода е, че използването на сребърни електролитни разтвори позволява да се получи неочаквано висок положителен ефект се дължи на комбинираното използване на антибиотици и сребърни електролитни разтвори или като отделна лекарствена форма.

По този начин, предложеният метод позволява ефективно да повлияе на микрофлората имащи хемолитична активност, което води до значително тегло на основния процес. Метод, както се използва в медицинската практика за неутрализиране на взаимодействието на патологични реакции N1u + Е. Coli щамове с тялото на пациента, да се прилага на разположение евтин и ефективен вещество, което инхибира действието на хемолизин. Методът се избягват възможни усложнения и значително намаляване на времето на лечение.

ЛИТЕРАТУРА 1. Hugnes C.D. Muller, J. Hacher и W. Loebel, 1982, Genetic и патогенетична роля Escherichie коли хемолизин. Toxican 20, стр. 247-257.

2. Х. У. Смит, Н.В. Хъгинс. Токсичното ролята на Alphahaemolisin в патогенезата на експериментална инфекция коли E. в мишки. J. Gen на Microb. 1985, 131, стр. 395-403.

3. J. Hacher, Н. Hof, L. Emody и Loebel. Влияние на клониран Ешерихия коли haemolisin henes, S. фимбрия и устойчивост серум на патогенност в ditterent животински модели. Microbiol. Патогенеза, 1986, N 1, стр. 1533-1547.

4. Bornside Cr. Bois P.J. Coch J. хемоглобин и Е.коли, а letal интраперитонеално complination. J. Bacteriol. 1968, N 5, стр. 1567-1571.

5. Rault М. М. СТунинг и W. Konig. Метаболизъм на левкотриени от 1-glutamyltranspeptidase и dipepsidase от човешка polimorphonu ясни granulocites. Immunology, 1985, N 55, стр. 135-137.

7. Mackman N. Холандия J.B. Секрецията на 107 далтона полипептид в средата от haemolytise Е.коли К 12 щам Mol Gen Jenet. 1984, 193, стр. 312-315.

8. OI Tsyganov. Бактериален хемолизинова и връзката им с вирулентност. Ставропол. MM 1982 година.

9. L. Романова, BI Mishankin, AN Kravtsov. Молекулно клониране и експресия на Hly-гена на Е.коли. Молекулярна генетика, микробиология, Virology, 1984, 2, 34.

10. Т. Maniatis, Е. Fritsch, J. Sambrook. Молекулно клониране. Мир, 1984

11. Kulsky LA Сребърна вода. Киев. "Naukova Dumka", 1987

1. Метод за потискане на хемолитична активност на патогенни щамове на Ешерихия коли, включващ използването на електролитен разтвор, при което на пациента се прилага електролитен сребърен разтвор в концентрация от 0.5-5.0 мг / л.

2. Метод съгласно претенция. 1, характеризиращ се с това, че електролитен разтвор на сребърен прилага едновременно с антибиотици.

3. Метод съгласно претенция. 1 и 2, характеризиращ се с това, че електролитен разтвор на сребърен прилага за 2-9 дни.