Eukaryotic репликация вилица

Репликация вилка има Y-образно асиметрична структура, тъй като методът на ДНК синтеза на "водещи" и "зад" вериги са различни. Бактериите геном е толкова малка, че всички ДНК може да бъде напълно повторен посредством само две вилки репликация. В хромозомите на бозайници на ДНК-веригата до 50 пъти по-дълго, така че пълната си репликация в разумен срок, ще трябва да работят едновременно много репликация вилици. Като цяло, във всеки S-фаза във всяка хромозома около 100 вилки. Механизми на репликацията на ДНК в по-висши еукариоти изследвани по-малко, отколкото в прокариоти, поради тяхната по-голяма сложност. Основните резултати, получени от системата за модел с SV40 ДНК вирус. където процеса на репликация е изследвана в инфектираните човешки клетки култивирани ин витро. В тази система, вирусен протеин, наречен Т антиген. Той изпълнява много функции необходими за вирусната ДНК репликация. Първо, това е протеин-инициатор, необходима за иницииране на репликация; Второ, има хеликаза активност ДНК, т.е. верига развива ДНК повторен преди провеждане на ДНК полимераза, и трето, Т-антиген необходими за правилното взаимодействие с ензимен комплекс ДНК синтезиращи праймери (primosome). Въпреки това, SV40 вирус използва, за да се реплицира ДНК хромозоми са малки и много от протеини от клетката гостоприемник, която позволява да се изследва действието на репликативна комплекс на човешки клетки по такъв относително проста система.

Методът, използван за първи път, за да разбера как да се копират хромозомите на еукариотите метод е разработен в началото на 60-те години. Клетките, растящи в култура се инкубират за кратко в присъствието на H3 тимидин така че ДНК синтезира по време на този период okazalps vysokoradiaktivnoy. Клетките бяха след това внимателно лизирани и тяхното DNA се прилага към повърхността на стъклото чрез разтягане възможно молекула. Стъкло покрити с фотографска емулсия и ДНК синтезата открива чрез авторадиография. Тъй като времето за инкубиране с белязан тимидин, се избира така, че вилката на репликацията е имал време да напредва по ДНК в няколко mikromeirov повторен ДНК сегменти са видими под микроскоп като линии на сребърни зърна, въпреки че ДНК остава невидима. Резултатът от такъв експеримент са Авторадиограма, в която проследява на повторен ДНК, дължината на които се увеличава с удължаване на периода на ON H3-тимидин.

Тези експерименти показват, че в хромозомите на еукариоти репликация вилици се движат със скорост от около 50 нуклеотида в секунда. Това е 10 пъти по-малка от тази на бактерии, евентуално свързани с по-голяма трудност в репликацията на ДНК опаковани в хроматин.

Всяка човешка хромозома очевидно се състои от единична ДНК молекула, съдържаща около 150 Mill. Нуклеотидите, така че за пълна репликация на такава молекула с единична репликационна вилици изисква 3 000 000 секунди, т.е. 800 часа! В действителност, S фаза трае 8-10 часа. Не е изненадващо, че методът на авторадиография разкрива съществуването на много независимо настъпващите репликация вилици във всяка еукариотна хромозома. Изненадващо различно: често се случва, че няколко контакти, разположени близо един до друг в същата ДНК региона, докато други области на същата хромозома те не съдържат. Чрез изследване на скоростта на вилиците на репликация и тяхното пространствено подреждане може да се определи посоката на движението им.

Тези експерименти показват следното:

1. Определени образование репликация вилици са подредени в групи, които се наричат ​​"репликация единици". Всяка група включва 20 до 80 начала на репликация. В групата на произхода на репликацията на разстояние една от друга при 30 000 -300 000 базови двойки.

2. По време на фаза S активиран нов репликативна единица, докато не се реплицира до всички ДНК.

3. В повечето случаи репликация вилици, подредени по двойки, една двойка от две вилки се движат в противоположни посоки от общ източник на репликация, се образува структура, наречена "репликация мехурчета" или "око".

4. репликативни единици репликация вилката на спре да се движи, когато се срещнат в близост до щепсела се движи в обратна посока. Така, ДНК в този регион на хромозома се реплицира до образуване на два пълна спирала дете.

5. По време на репликация вилици S фаза се движат около една и съща скорост.