Biotechnology генното инженерство ензими - обратна транскриптаза
Ензимите генното инженерство
обратна транскриптаза
Обратната транскриптаза се използва за транскрипцията на иРНК в комплементарна ДНК верига. При изучаване на ретровируси, геномът на който съдържа едноверижни РНК молекули, беше установено, че в процеса на вътреклетъчен етап ретровирус интеграция преминава своя геном под формата на двойноверижна ДНК в хромозомите на клетката гостоприемник. В 1 964 гр. Temin предположено съществуването virusspetsifichnogo ензим способен да синтезира РНК комплементарна матрица ДНК. Усилията за изолиране на ензима са неуспешни и Temin 1970 грама. Mizutani с и независимо от Балтимор отвори желания ензимен препарат извънклетъчни вириони на Rous саркома вирус. Тази РНК-зависима ДНК полимераза нарича обратна транскриптаза или обратна транскриптаза.
Най-подробно изучаване на антиретровирусни обратната транскриптаза птици. Всяка вирион съдържа около 50 молекули на този ензим. Обратната транскриптаза е съставен от две субединици - а (65 Ша) и В (95 Ша), присъстващи в еквимоларни количества. Обратната транскриптаза има най-малко три ензимни дейности:
1) ДНК полимераза, като се използва като шаблон и двете РНК и ДНК;
2) активността на RNase Н хидролизира РНК в РНК хибрид състав - ДНК, но не единично или двойно верижна РНК;
3) ендонуклеазна активност ДНК.
са необходими за синтез на вирусна ДНК и ендонуклеаза Първите две дейности, както изглежда, е важно за интеграцията на вирусна ДНК в генома на клетката гостоприемник. Пречистена обратна транскриптаза синтезира ДНК от двете РНК и ДНК матрици. За стартиране на синтеза, обратна транскриптаза, както и други полимерази, необходимо кратко двойноверижна част (праймер). Праймерът може да бъде едноверижен сегмент на РНК, така и на ДНК, която по време на реакцията са ковалентно свързани към ДНК верига новопроизведени.
Фиг. Схема 35. Синтез на двойно-верижни ДНК копия на РНК молекули
Обратната транскриптаза е за предпочитане да се използва за транскрипция на РНК в комплементарна ДНК (кДНК). Реакцията на обратна транскрипция се провежда в специално избрани условия използват силни инхибитори на RNase активност. По този начин е възможно да се получи пълната дължина на DNA копие на целеви РНК молекули. Тъй като праймер с обратна транскрипция на поли (А) съдържащ иРНК, използвайки олиго (DT), и за РНК молекула липсва Z'-поли (А) край, - химически синтезирани олигонуклеотиди проучен комплементарна Z'-край на РНК. След синтеза на иРНК ДНК комплементарна верига и унищожаване РНК (обикновено се използва алкално третиране) се осъществява синтез на втора ДНК нишка. Така възможността да се използва обратна транскриптаза за образуване на 3'-краища на едноверижна сДНК беше самодопълващи се фиба, които могат да изпълняват функцията на праймер.
Шаблонът служи като първа верига кДНК. Тази реакция може да бъде катализирана от двете обратна транскриптаза и ДНК полимераза I на E.coli. Показано е, че комбинацията от тези два ензима увеличава добива на пълноценни сДНК молекули двойноверижни. При завършване на синтезата на първата и втората нишка сДНК остава ковалентно свързан фуркетна бримка, която служи като праймер за синтеза на втората верига. Този цикъл се разцепва от ендонуклеаза S1, специфично унищожаване едноверижни нуклеинови киселини сайтове. Създадена в краищата не винаги са тъп, и да се подобри ефективността на последващо клониране се поправи, за да притъпи с Klenow фрагмент на ДНК полимераза I на E.coli. Получената двуверижна сДНК след това може да се вгради в клониращи вектори се размножават в хибридни ДНК молекули и да се използват за по-нататъшни изследвания.
Други глави в този раздел: