Алерген за диагнозата на туберкулоза и методът за тяхното производство

Употреба: ветеринарната имунология, биологичен продукт, алергична диагноза на туберкулоза. ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО алергена за диагнозата на туберкулоза е endoprotein изолирани от щама на култура филтър Mycobacterium Boris N8, Mol. т. 15 100 Ша, като тест за активност в алергичен 50000 10000 IU / мл. в производството на "UV туберкулин" брой производствени етапи се намалява два пъти в сравнение с използвания метод за получаване на препарат от утаяване на протеин и degidratantami технологичен цикъл е затворен и чисти, без замърсяване на агресивни вещества. Препаратът се получава чрез ултрафилтрация. За тази цел култура филтрат Mycobacterium туберкулоза на, отглеждани върху синтетична среда и инактивиран чрез нагряване, преминава през филтрираща мембрана с капацитет на задържане на 100 кД, след това полученият пермеат се концентрира върху мембрани с капацитет на задържане на 15 Ша и нормализира съдържание IU, натрий и фенол хлорид в 1 мл. 2. п. е Ly 2-ил.

Изобретението се отнася до имунология, по-специално за производство на биологични продукти за алергични диагнозата на туберкулоза.

Известен използва за тази цел в света пречиства PPD (пречистен протеин производно) туберкулин, която е протеин, получен по химичен път от култура филтрат Mycobacterium туберкулоза, отглеждани върху синтетична среда [1, 2, 3] Протеин от култура филтрата се утаява с трихлороцетна киселина, амониев сулфат, последвано от пречистване си чрез многократни преутаяване определени реагенти или алкохол. Такъв метод за производство на туберкулин се използва във всички страни, които произвеждат лекарството. По този начин, във вътрешното производство туберкулин технология за ветеринарни цели протеин от Mycobacterium туберкулоза култура филтрата се утаява с трихлороцетна киселина, утаява с амониев сулфат и се освобождава от сулфати чрез диализа срещу чешмяна вода (схема 1, фиг. 1).

В медицинската практика, протеинът се утаява с трихлороцетна киселина, след това се пречиства и дехидратира с алкохол и ацетон.

Такова туберкулин е смес от различни молекулно тегло фракции от пептиди с ниско молекулно тегло на високомолекулни съединения протеин молекулни. Съдържащите се в туберкулинови макромолекулни протеинови фракции имат антигенност да индуцира образуване на антитела в животни, и незабавно тип свръхчувствителност [4] намаляване на специфичността вида на препарата, което усложнява диагнозата на туберкулоза и изисква използването на допълнителни методи на изследване при установяване на животното за болестното състояние.

Производствен процес туберкулин отворен и многостъпални, когато обработка протеин случва замърсяване неговата микрофлора, което води до образуването на получаването на протеолитични ензими, които намаляват туберкулин активност по време на съхранение [5] и други чужди протеини, които се отрази негативно върху спецификата на лекарството.

На различни етапи от процеса има голяма загуба на протеини. Тези загуби количество (по отношение на първоначалното съдържание на протеин в филтрата култура) на преципитация с трихлороцетна киселина и 42% амониев сулфат до 30% чрез диализа до 4% от крайния добив протеин е 20% до първоначалното [6] Използването в производството на лекарствени агресивни химикали и след това се заустват в канализационната система замърсяват околната среда.

Известно е, да се използва в производството на метод пречистен туберкулин kolloksilinovye чрез ултрафилтрация или друга мембрана да се концентрират органичните съединения в филтрата култура и отстраняване на не-колоидни съставки и ниски обмен и микобактерии автолиза продукти молекулни. Tuberkuloprotein на такъв концентрат след това утаеният degidratantami (трихлороцетна киселина, амониев сулфат) [1, 2, 7], че не се намали количеството на протеини с високо молекулно тегло.

Също така е известно, че се използват в лабораторията като се използва метода на ултрафилтрация мембрани с различен капацитет на задържане за изолиране на причинителят на туберкулозата култура филтрат протеинови фракции с различни молекулни тегла, за да се проучи техните свойства [12, 13] (прототип). Методът се състои в култивиране на причинителят на туберкулозата човешки вид, щам H37 Rv, синтетична хранителна среда култура филтрат отделение и споделяне на филтърните мембрани с капацитет на задържане на 10 kDa и 1 Ша. Тъй като част от концентрат, съдържащ съединение с молекулно тегло 10 kDa и по-висока, туберкулин протеин, получен чрез утаяване с амониев сулфат, последвано от обезсоляване на разтвора, стерилизиращ филтруване и лиофилизация.

Все пак, въпреки положителните резултати от някои от тези проучвания, метод за производство на туберкулин ултрафилтрация все още не е намерил практическо приложение поради ниския добив на продукт с тесен молекулно тегло на съдържащата се в него протеин и следователно икономически неизгодно технология.

Освен това, туберкулин, произведен от М. туберкулоза, съдържа повече генерични микобактериални антигени в сравнение с лекарството, което се използва за производство М. говежди, което представлява неговата ниска специфичност видове и животни, заразени с М. говежди, реагира по-голяма степен на хомоложни алерген [8, 9, 10] Следователно, за ветеринарна употреба в диагнозата на туберкулоза при животни е по-целесъобразно да се повиши ефективността на използване изследвания формулировка получава от М. говежди.

Целта на изобретението е да се осигури туберкулин, състояща се от най-активен и специфичен участък на протеин спектър на Mycobacterium туберкулоза, с непрекъснато и икономичен процес без използването на химически реагенти.

Това се постига чрез отглеждане в синтетична среда М. говежди, щам N 8 [11] за 6-8 седмици, инактивирането култура чрез автоклавиране, културата филтрат отделение от бактериалната маса минава през кърпа плоча филтър и се филтрува. След това, получената култура филтратът се прекарва последователно през мембраната (пластинчати, сплескани или като кухи влакна) с задържане на 100 и 15 Ша.

След ултрафилтрация през мембрани от 100 Ша концентрат изхвърля. Филтратът се подлага на ултрафилтруване през мембрани от 15 Ша, в изхвърля Филтратът и концентратът, съдържащ съединение с молекулно тегло 15-100 Ша, се използва като желания продукт (Схема 2 процеса на производствения процес "UV туберкулин" на фиг. 2).

А схеми за сравнение 1 и 2 (фиг. 1 и 2), в производството на "UV туберкулин" брой производствени стъпки се намаляват до 2 пъти.

ПРИМЕРИ Пример 1 за производството на "UV туберкулин" 100 литра култура филтрат М. говежди, щам N 8, отглеждани в продължение на 8 седмици в синтетична среда и инактивиран чрез нагряване, преминали през филтрационни мембрани режим концентрация с капацитет на задържане 100 Ша. Степента на концентрация е равна на 50. По този начин се получават 2 литра концентрат и 98 L от пермеат.

Концентратът, съдържащ съединението с молекулно тегло повече от 10 kDa, се изхвърля и пермеат със съединения с по-малко от 100 Ша се филтрира през мембрана с капацитет на задържане на 15 Ша в режим на концентрация. Степента на концентрация на разтвор, съдържащ съединението с молекулно тегло от 15 до 100 кД, равен на 10. По този начин 9.8 л на концентрат се получава, и 88.2 литра пермеат, съдържаща нискомолекулни вещества.

Пермеатът се изхвърля и концентратът се разрежда с разтвор на натриев хлорид, съдържащ фенол и глицерол, за да се получи 1-мл туберкулин разтвор 1 мг протеин, 0.85% натриев хлорид, 10% глицерин и 0.3% фенол.

Формулировка се подлага на стерилизация филтруване и се опакова асептично в ампули капацитет 10 и 20 мл.

Пробите бяха изследвани за активност в сравнение с референтната серия PPD-туберкулин на бозайници в съответствие с ГОСТ 16739-88 "пречистен туберкулин (PPD) за бозайници" и специфичността видове в съответствие с ТУ 10-19-518-87 "алергени сух пречистен комплекс на атипични микобактерии (КАМ) ".

ПРИМЕР Пример 4. Тест видова специфичност "UV туберкулини" съдържащ протеинови фракции мол. т. над 100 и по-малко от 100 Ша, в сензибилизирани морски свинчета със смес от култури skotohromogennyh (М. scrofulaceum) и nefotohromogennyh (М. intracellulare) атипични микобактерии. В този определен по-изразен видовата специфичност "UV туберкулин" съдържащ протеинова фракция молекулно тегло: най-малко 100 Ша, броят на отговор на това лекарство животни е 1,5 пъти по-малко, и реакционната смес при животни реагират 1.2 пъти по-малко интензивен.

Резултатите от експерименти 3 и 4 показват, че активността на Mycobacterium туберкулоза протеин не зависи от тяхното молекулно тегло и видове специфичност tuberkuloproteina се увеличава с намаляване на молекулното тегло на протеина. Така, отстраняването на протеини туберкулинови молекулно тегло над 100 Ша увеличава видовата специфичност.

(56) 1. Seibert F.B. Изолирането и свойства на пречистения psotein производно на туберкулин Am. Rev. Tuberc. 1934, кн. 30, N 6, стр. 713-720.

2. Linnikova MA Пречистеният протеин производно на туберкулин ,. на Проблемът на туберкулоза, М. 1939, N 12.

3. Tsumina Т. Kuvabara C. Методът за производство на туберкулин. Японски патент N 582 745, 19.9.73.

4. Петров RV Имунология. М. Medicine, 1983, стр. 368.

6. Shevyrev NS Подобряване на технологията на промишлени сух пречиства туберкулин при бозайници. Tr. VGNKI ветеринарни препарати, М. 1972 т. XVIII.

7. Collins Е. Lamb J.R. Чун D.B. Заразяват и Immun. 1988, кн. 56, N 5, стр. 1260-1266.

8. Lesslie I.W. Хъбърт C.N. BIRN К.Т. Сравнение на спецификата на човешки и говежди туберкулин PPD за тестване на едър рогат добитък. 1. Република Ирландия Vet. Rec. 1975, кн. 96, N 15, стр. 332-334.

9. Chaparas СД Състав на антигени от различни микобактериални видове, открити с с позоваване туберкулоза серум М.. Амер. Rev. Респ. Dis. 1975, кн. 112, М 1, стр. 135-137.

10. Baizden L.A. Сравнение на протеините и особеностите на човешки и говежди туберкулоза Amer. J. Vet. Res, 1952, с. 13, N 48, стр. 338-344.

11. Инструкции за производство и контрол на туберкулин пречистен (PPD) за mlekopit. одобрен. BS 30/12/85.

12. Affronti L.F. Ouchterlony О. Lind A. et. Ал. Туберкулоза, 1983, N 2, стр. 66-68.

13. Affronti L.F. Ouchterlony О. А. Lind Ridell М. Wisingerova E.A СЗО усилие за изолиране на туберкулинов кожен тест вид специфичен. Int симпозиума BCG ваксини и туберкулини, част М. Будапеща, 1986, стр. 503-509.

1. алерген за диагностициране на туберкулоза, характеризиращ се с това, че щам, изолиран от Mycobacterium Boris N 8 endoprotein изолиран от култура Филтратът от следните биохимичен състав, Protein 70 80 Lipid 05 август 04 август полизахарид, нуклеинова киселина ДНК 0,5 1,5
РНК 0,10 0,15
молекулно тегло от 15 100 кД поради използването на мембрани с капацитет на задържане 15 и 100 Ша;
алергична активност тест 50000 10000 IU / мл.

2. Метод за получаване на алерген за диагнозата на туберкулоза, съдържащ отглеждане на култура на щама на микобактерии в синтетична хранителна среда, инактивиране автоклав, културата филтрат отделение, неговата концентрация чрез ултрафилтрация, отделяне на филтрата, последвано от повтаря концентрация чрез ултрафилтрация и изолиране на желания продукт под формата на концентрат, характеризиращ се с това, че култивираните щам Mycobacterium Boris N 8, концентрация чрез ултрафилтрация се извършва върху мембрана с праг на отделяне на 10 100 Ша повтаря концентриране на филтрата, получен с мембрана се осъществява на прага на разделяне 15 1.5 Ша, очаквания продукт се изолира с мол. т. 15 100 кД.