Като и фиксиране - на практика histologist
СЪБИРАНЕ И строителния материал
(G.A.Merkulov разбира patologogistologicheskoy технология - .. 1967.
Най-важните условия за получаване на висококачествени хистологичните препарати са:
1. най-ранната възможна получаване на материали,
2. минимална травма тъкан,
3. адекватно фиксиране.
Технология на рязане МАТЕРИАЛ
Оптималната областта на тъкани парчета с 2 - 3 см 2. Дебелина 5 - 7 мм.
Изрязани парчета плат директно от острието се потапя в ключалката. Неприемливо стискане парчета, да ги измиване с вода и почистване на повърхността на тялото, особено на лигавицата, инструменти, пръстите на ръцете и т.н. След потапяне парчетата в контейнер със скоба се понижава до същия брой етикет (шифър маркировки) писмено с молив или мастило върху фотографска хартия матова повърхност. В случаите, когато е необходимо да се поставят етикети всяко парче, той, заедно с етикет, вързана на марля чанта. Възможно е също така за садене части нишка: първите 2 - 3 пъти на първата част е зашит етикет, тогава той режа, а след това на следващия етикета и така нататък до 10-15 парчета.
В Самара OBSME също проведе маркировка парчета от тела върху картона с подписите на неизтриваемо мастило, след рязане парчета картон с надпис поставя в марля възел с подрязани парче.
В присъствието на анормални области на парчета тъкан и органи намаляване на границата с нормалната тъкан.
Парчета от кухи органи са изрязани, така че в подготовката са видими всички слоеве на стената. Slices стена на кухото тяло, която е разпръсната върху фотографска хартия или картон.
За проучване на съдовата стена, върху голяма площ се нарязва надлъжно, търкаля го на руло и зашит в средата.
За изучаване хлабави съединителната тъкан подготвени забулващи лекарства: след внимателно дисекция на съединителната лента разтегателни пинсетите да слезете стъкло и фиксирани.
Общите принципи на ФИКСИРАНЕ
Фиксиране стабилизира структурите на тъканите и тяхната печат. Механизмът на действие се основава на клипове коагулацията протеини и липиди стабилизация.
Фиксиране винаги води до по-големи или по-малки промени в структурата и обема на тъканта, тежестта на който зависи от рН на държача, неговата концентрация, температура, продължителност на експозицията и други фактори. Концентрацията на водородни йони капаче трябва да съответства на тази на тъканите, обаче фиксатор трябва да има рН близо до неутрално. Заключването на повишаване на температурата ускорява процеса, но тя все още е голяма промяна в тъканите. Твърде дълго фиксация води до значително уплътняване на материала, което допълнително усложнява неговата работа. За всеки тип изследване избран най-подходящият държача. Колкото по-малко деформация ще претърпи тъканни структури по време на записа, толкова по-бързо и по-дълбоко ще бъде въздействието им върху плата, толкова по-добре се счита фиксаж течност.
Пълна фиксиране на материала, предоставена по силата на определени изисквания.
1. След рязане парче тъкан веднага се потапя в ключалката.
2. Обемът на бравата трябва да надвишава количеството на материала захапва от 10-20 пъти. тъй като течност тъкан може значително да се промени концентрацията на държача.
3. В случай, че промените цвета на ключалката след потопите в нея, парчета плат, скоба трябва да се промени веднага.
4. Избягвайте многократно използване на скоби.
5. За всяка ключалка да се спазва определено време на фиксиране. Продължителното излагане на материала е възможно само в някои скоби, като например 10% неутрален формалин, течност на Bouin.
За да се определи по-добре да се използват контейнери с широко гърло, така че няма проблеми с премахването на фиксираната материал. Еднородност фиксиране губят някои тъкани като белия дроб, това се постига чрез поставянето им на дъното на банките, и върху тях - полагане на слой от марля или памук. Тази техника позволява да се избегне дефект фиксиращи части от белодробната тъкан във формата на тяхната адхезия към ръкавиците покриващ буркан с последващото развитие на парче автолиза. С голям брой материални парчета като вътрешен слой памук или марля.
Най материал се определя при стайна температура, но за някои видове изследвания (хистохимия, електронна микроскопия и т.н.) трябва да се извършва фиксиране при 4 ° С Материал спешни биопсии фиксирани при повишена температура консервант. Когато бързо фиксиране в дълбините на обекта бързо развиващата се автолитичното процеси.
Просто определя FLUID
Формалин. Основната често използвани Фиксаторът е формалин, което е 40% разтвор на формалдехид. От него се получават неутрален (буфериран до рН 7.0) 10-12% формалин. За тази цел в буркан с 40% формалин излива калциев или магнезиев карбонат или смес от тези соли - скорост доломит от 100 г на 1 литър формалин. За 10% неутрален формалин при 24 часа до 1 част 40% неутрален формалин се прибавя 9 части вода от чешмата. Продължителност определяне на 24-48 часа при 20 ° С
Universal скоба, подходяща за повечето хистологични и хистохимични изследвания, е неутрален формалин за Lilly.
А. 100 мл 40% формалин + 900 мл дестилирана вода.
Б. 4 грам натриев дихидроген ортофосфат монохидрат (натриев дихидроген фосфат).
Б. 6,5 г двуосновен натриев (динатриев фосфат).
Ако дъното на бурканите с 40% формалин се образува бяла утайка (параформалдехид), той може да бъде разтворен, нагрява се до 70-80 ° С (в качулка!), И се използва за фиксиране.
Етилов алкохол (80%, 90%, 96% и 100%). Той се използва като консервант за откриване на гликоген, желязо, амилоид, но тя се разтваря липиди. Механизмът на действие се основава на утаяването на протеините. това е придружено от дехидратация съоръжения, които значително ускорява окабеляване. Продължителността на фиксиране на от 2 часа до 1 ден. Увеличаването на дължината на фиксиране, особено в 100% алкохол, е нежелателно, тъй като материалът се уплътнява значително и се среща прекомерно изсушаване. Оптималната температура за фиксиране на материала в алкохол 4 ° С, но тя може да се проведе при стайна температура. Ако след алкохол фиксиране на тъкан се нарязва на замръзване микротом или криостат, парчетата се промиват в продължение на 1-2 часа преди пълното потапяне на дъното на брега, където тъканта е наситен с вода.
Ацетон (своя ефект, подобен алкохол). Ацетон се използва за увеличаване на скоростта на фиксиране. Прилагане 100% ацетон, за да се получи ацетон се излива в търговски калцинирания меден сулфат (Bluestone) или силикагел. В ацетон фиксирана срезове с дебелина 3-4 mm в продължение на 2 часа при 20 ° С или 30 минути - 1 час в термостат при 60 ° С в плътно затворен контейнер. Ацетон значително уплътнява тъкан и чрез удължаване на фиксиране може бръчки обекти. Най-ацетон се използва за обработка на материала в неговите спешни биопсии излива в парафин.
Живачен хлорид (живак дихлорид). Sulemu използва като консервант в началото на хистология. Приготвя се наситен разтвор на 10 г живачен хлорид в 100 мл дестилирана вода или изотоничен разтвор на натриев хлорид, доведен до кипене, охлажда се и се филтрува. Продължителност на фиксиране парчета с дебелина 3 мм 6-12 часа при 20 ° С Когато може да се получи фиксиране живачен хлорид в тъканите на кристална утайка, която се отстранява чрез третиране на йодирани филийки 70% алкохол (50 мл 70% алкохол - 5-10 капки 5% алкохол разтвор на йод до оранжев цвят). Както избелване йодиран алкохол с секции се заменя с прясна порция до пълна загуба на цвят, и след това секциите се промиват в 3 - 4 промени от 70% алкохол.
Съставните части са прости сложни скоби. Има много варианти на смесите фиксиращите. По-долу са най-често срещаните.
Формол-алкохол от Schaffer - 10% неутрален формалин, която се получава от 1 част от 40% неутрален формалин и 2 - 3 части от 96% алкохол.
Продължителност определяне 24-48 часа. Не се изисква нататъшно промиване вода и материалът, незабавно се поставя в 96% алкохол.
40% неутрален формалин 100ml
Натриев хлорид 8,5 гр
Чешмяна вода 900 мл
Продължителността на фиксиране на 48 часа при 20 ° С, последвано от промиване с течаща вода в продължение на 6-12 часа.
Buena течност - класически заключване за експериментални изследвания.
наситен разтвор на пикринова киселина 75 мл
Neutral 40% формалин 25 мл
Ледена оцетна киселина 5 мл
Продължителност фиксиране 1-24 часа при 20 ° С
Наситен разтвор на пикринова киселина се получава предварително базирани 3а кристален пикринова киселина в 1 литър гореща дестилирана вода. След фиксиране парчета се промива от излишък на пикринова киселина в 70% етанол, след това поставени в парафин.
Калциев-формол от Бейкър използва за фиксиране на липиди.
А. 10 мл 40% формалин + 90 мл дестилирана вода.
Б. 1 г калциев хлорид.
Решения А и В се смесват.
Продължителност определяне на 24-48 часа при 20 ° С
Carnoy на течност - Universal държач за най хистологични и хистохимични изследвания (освен за откриване на липид).
Алкохол 100% 96% или 60 мл
30 мл хлороформ
Ледена оцетна киселина 10 мл
Продължителност фиксиране на 2-4 часа при 4 ° С или на 1-2 часа при 20 ° С След това материалът се поставя в 100% алкохол. Ако материалът не е пряко предмет на кабели, може да се прехвърля в 96% алкохол и държат там до 3 дни.
KarnuaI използва като фиксатор, състоящ се от 100 мл 75% алкохол и 25 мл ледена оцетна киселина. за определяне на условията, са едни и същи.
При липса на етилов алкохол вместо течност Carnoy може да бъде смес със следния състав.
Изопропилов алкохол 60 мл
Пропионова киселина 30 мл
Продължителност определяне 12-24 часа при 20 ° С; Изопропилов алкохол се използва за измиване и обезводняване.
ПРАВИЛА васал
Почти всички ключалки са токсични вещества (алдехиди, ацетон, алкохол), някои токсични (живачен хлорид, осмиев тетраоксид, метанол), и следователно трябва да отговарят на предписанията за безопасност при работа с реагентите, използвани в хистологични практика.
Фиксиране и рязане материал трябва да бъде направено в аспиратор. Материал извлича от фиксатор, съдържащ формалин, за предпочитане в рамките на няколко минути измийте с течаща вода като формалин изпарения дразнят лигавиците на очите и дихателните органи.
Възможни артефакти, свързани с фиксиране,
И РЕШЕНИЯ
Когато формалин фиксиране, особено кисели, могат да се появят в секции на тъмно кафяв пигмент под формата на гранули или бучки (в резултат на взаимодействие с хемоглобин формалин тъкани). Пигменти се отстранява чрез поставяне на срезове за 15-20 минути при 1-5% амонячен разтвор или 70% алкохол. След промиване с вода, препаратът може да се боядисва. Добър пигмент се отстранява в 1% разтвор на калиев хидроксид в 80% етанол (01:25) след излагане на 10 минути лекарство се промива с течаща вода в продължение на 5 минути.
В случай на значителен резултат тъкани печат в твърде дълги парчета фиксиране се поставят в продължение на 1-2 часа в 10% разтвор на лимонена киселина (материала става по-мека и по-подходящ за изследване).
кристална утайка, образувана след фиксиране с живачен хлорид се отстранява от парчета или резени е по-добре с помощта на йодиран 70% алкохол.
Histologist micropreparations проучването трябва да се вземат предвид редица възможни артефакти, причинени от фиксацията на материала:
1. Развитието на тъкан автолиза на големи съоръжения или на лошо фиксиране, оценката на секции е ограничен (не е възможно надеждно да се изрази тежестта на тъкан оток, тежестта на дистрофични изменения в клетки, клетъчна реакция, като гниене на клетъчни елементи на фон автолиза на) ,
2. компресия на тъканите при тяхното фиксиране (може да бъде до 40% от първоначалния обем) и подуване на тъкан по време на фиксиране водят до артефакти когато mikromorfometrii (например, увеличаване на броя на левкоцитите в зрителното поле на микроскоп на време фиксиране на меките тъкани на обекта 72 часа или повече, в сравнение на същото парче мека тъкан, фиксирана 24-48 часа)
3. Механично увреждане на нервна тъкан при откриването на черепа, мозъка проучване - свиване, hyperchromia невронална ядра тяхната деформация,
4. трайна артефакт в централната нервна система - перисъдово и периклетъчни празнина погрешно диагностицирана като периклетъчни и перисъдово оток и др.
Фиг. 6, 7. Огнища гнилостните емфизем в бъбречната тъкан, изразено автолиза. Хематоксилин-еозин. Увеличаването на X100.
Аутопсия хистологични признаци на замразяване трупове тъкани.
В тъкан след смъртта им замразяване под микроскоп в видима игла или пчелна пита кръгли, овални дефекти (разгражда следи от разтопено ледени частици). В това състояние на тъканите да се говори автентично за кръвта им пълнеж, наличието и тежестта на оток, редица патологични състояния, не е възможно.
Фиг. 1, 2. аутопсия признаци на замразяване в миокарда под формата на гъсто разположени заоблени-овални пита дефекти, кухини, срещу умерено експресирани автолитичното промени. Хематоксилин-еозин, увеличение x100 и H250.