Диагностика на коронавирус инфекция чрез полимеразна верижна реакция (PCR)

Коронавирус инфекция на котки и кучета са причинени от членове на рода коронавирус на (семейство Coronaviridae). Основната проява на коронавирус инфекция при кучета е диария. V корона вируси причиняват ентерит и котка инфекциозен перитонит, разпространена сред диви и домашни котки.

агент причинител на коронавирус инфекция при кучета е кучешки коронавирус, коронавирус причинява остра ентерит. Заболяването се разпространява чрез директен контакт с носителя на вируса (чрез слюнка и фекалии). Тази инфекция чувствителни кучета от всички възрасти, но най-често се отразява на малки кученца и слаби животни, които вече са имали друго заболяване, като например парвовироза.

Основните симптоми на заболяването - повръщане и диария, понякога смесени с кръв, дехидратация, загуба на тегло, летаргия. 3-4 седмици след възстановяване могат да се развиват рецидивиращо заболяване. При извършване на диагностика на коронавирус, ентерити кучета трябва да бъдат разграничени от парвовирус ентерит, аденовирус инфекция на типа на чревния и гана.

Корона, засягащи котки, са представени от две биологичните видове: FECV или коронавирус ентерити котки и FIPV - вирус инфекциозен перитонит на котки (2, 3). FECV превозвачите е между 16-50% от домашните котки, при които вирусът е локализирано в тънките черва, без да причинява заболяване или да станат причина лека диария. В същия момент 5-12% от носители могат да се наблюдават мутации инфлуенца форми на чревната инфлуенца в FECV (FIPV), което води до развитието на болестта (2).

Инфекциозен перитонит (SP, FIP) котки, завършващи обикновено е смъртоносна, се среща в две форми - мокри и сухи. мокър (ексудативна) форма SP се характеризира с увреждания на кръвоносните съдове на коремните кухини или гръдни, придружен от плазма ексудация в кухината (фиг. 1). Пациенти животни развиват асцит (Фигура 2), и в случай на натрупването на течности - нарушение на дихателната функция. В серозен обвивка коремната кухина, образувана фибринозни депозити (фиг. 3), по-долу, могат да образуват сраствания. Поради нарушения на чернодробната функция наблюдава ekterichnost склерата и кожата.

Суши се (nonexudative) IP форма става без натрупване на течност в корема и гръдни кухини. В този случай, засегнатите вътрешните органи -. Мозъка (Фигура 4), черен дроб, бъбреци, панкреас, 25% от наблюдавания увреждане на очите (Фигура 5) (5).

Тъй като ефективен режим на лечение SP все още не е развит, са от първостепенно значение профилактични мерки, насочени към ранно откриване на вирусна инфекция (1, 3).

Диагностика на инфекциозен перитонит на котки също е сериозен проблем. Традиционните методи за откриване на патоген базирани на откриване на антитела за коронавирус (IHA ELISA), осигуряват до 60% неверни положителни резултати. Това се дължи на присъствието в червата на котки опортюнистични патогенни щамове (2, 3). Броят на чуждестранните лаборатории използваният комплексен метод за диагностика, SP, включително определение:
- титър антитела коронавирус;
- съотношението на албумин / глобулин трансудат или плазма;
- ниво-1-киселина гликоприл теин (AGP);
- цитологично и хематологични параметри (4).

Материали и методи
Проучването коронавирус щам "Bagheera" се използва (1og 5 TCD 50 / мл) при разреждания, 8 изолати на коронавирус котки (FCoV), 2 изолати на коронавирус на кучета (CCV) и калицивирус на вирусна суспензия и котешки панлевкопениен котки.
Когато PCR тест на системата за изпитване се използва биологичен материал на здрави котки, животни с клинични признаци на SP и котки с неспецифични симптоми. Сред тестваните животни и двете се съдържат в разсадници, и са в отделните съдържанието.
Биологичен материал се изследва паралелно чрез PCR и RIGA. Използване на PCR системи са изследвани изпражнения, кръвна плазма, асцит трансудат на специфичен и метод RIGA - кръв и серум трансудат.

Серологични тестове бяха проведени с помощта на кит за откриване на антитела на коронавирус месоядни в RIGA (ТУ 9388-025-00494189-01). Биологичен материал кучета се изследва по метода PCR.

Това изследване обаче изисква значителни инвестиции на време и пари. В тази връзка, ефективен метод за диагноза SP може да служи като полимеразна верижна реакция (PCR), което позволява не само да се открие котки коронавируси, но диференциацията на патогенните и условно патогенни щамове на базата на тяхната различна локализация в тялото. Така откриване на вируса в изпражненията на котки показва носители на опортюнистични щамове (FECV) и кръвната плазма или асцитна течност, - циркулира в тялото на патогенни щамове животни (FIPV) и следователно на заболяването.

Целта на това изследване - тест на системата за тест за диагностициране на коронавирус инфекция при кучета и котки на базата на PCR.

Изолиране на РНК се извършва чрез използване на набор от "РНК-Sorb" (CRIE) на базата на метода за неговото сорбция върху силикагел. PCR се осъществява в термоциклер TERTSIK ( "ДНК технология") като стандартна процедура. Получените PCR продукти бяха визуализирани с електрофореза в 1.5% агарозен гел, съдържащ етидиум бромид.

бяха избрани целеви специфични праймери за консервативни последователности в две нуклеокапсиден протеин ген. Спецификата на праймерите предложените учи използват компютърни програми FASTA и BLASTA. В резултат на тази работа се откри хомология на избраните олигонуклеотиди само гени FCoV и CCV нуклеокапсиден протеин и намериха значителна хомология на нуклеотидните последователности от други видове от семейство Coronaviridae, както и други вируси, бактерии и еукариоти. Така, предложените праймери, базирани на теоретични изчисления, трябва да имат 100% специфичност.

В следващата фаза на изследването са оптимизирани условия за изолиране на вирусна РНК и обратна транскрипция и PCR, както определената специфичност и чувствителност на PCR анализ. размер на PCR продукт е 350 нд. Метод показа 100% специфичност и висока чувствителност. Откриване на коронавирус в изпражненията на котки показателни за превозването на опортюнистични щамове в червата, FECV детектиране на трансудат на кръвната плазма и - върху развитието на болестта.

В проучването от IHA се счита за положително откриване на титър животно антитяло> 1: 128. Все пак, това може да означава едно от вирус, както и явна форма на инфекцията. Освен това, положителен титър може да се дължи на наличието на контакт с коронавирус горе. Тъй като материалът на изследваните кучета изпражненията, и тяхното разкриване коронавирус РНК показателно за заболяване, причинено от CCV.

Биологичният материал се събира от 193 котки (Таблица I) се изследва по време на експеримента. Метод RNGA положителен резултат се записва в 131 животно (титри> 1: 128). При изпитване на "серопозитивни" котки коронавирус РНК от PCR се открива в плазмата и асцитна течност на 12 животни (9%) само в изпражненията - 68 (52%) и 51 (39%) - не се засича изобщо. Така, 52% от котките са серопозитивни резултат подкрепя условно патогенни щамове коронавирус, а 39% са здрави. Очевидно е, че проучването на IHA даде 63% lozhnopolozhitelngh резултати (на базата на общия брой на тестваните животни).

заключение
Резултатите показват, че диагнозата на коронавирус инфекция на котки конвенционален метод серологични (Ша) дава повече от 60% фалшиво положителни резултати, тъй като тя не позволява да се разграничат една истинска държавна носител на болестта. В допълнение, "серопозитивни" се считат за животни, които са имали контакт с коронавирус рано.

Използването на PCR позволява диференциация на патогенните и условно патогенни щамове поради тяхната лична време локализация в тялото, и за разграничаване на състоянието на носител от болестта. По този начин, данните от проучването сочат, възможността за използване на метода PCR за откриване на коронавирус, котки и кучета, както и да постави окончателната диагноза.

EA Yaralova, IL Obukhov, MM Рахманинов, EI Elizbarashvili, V.I.ULASOV,
Vsebolgarsky членка център за качество и стандартизация на наркотици Животински и Feeds, София