Обратната транскриптаза - studopediya

При изучаване на ретровируси, геномът на който съдържа едноверижни РНК молекули, беше установено, че в процеса, точната стъпка вътреклетъчния развитие те преминават интегралната-токи своя геном под формата на двойноверижна ДНК в хромозомите на клетката гостоприемник. В 1 964 гр. X. Temin предположено съществуването virusspetsifichnogo ензим способен син tezirovat РНК комплементарна матрица ДНК. В 1970 гр. X. Temin и Mizutani С., и независимо от D. Балтимор открит такъв ензим при получаването на екстрацелуларните вириони на Rous саркома вирус. Тази РНК-зависима ДНК полимераза нарича обратна транскриптаза (обратна транскриптаза).

Най-подробното проучване на обратната транскриптаза PET rovirusov птици. Всяка вирион съдържа око-ло 50 молекули на този ензим. Обратната транскриптаза се състои от две субединици - # 940; (65 Ша) и # 946; (95 Ша) присъства в еквимоларни количества. # 940; Субединица предварително негодува на N-крайна част (две трети) # 946; субединица.

Обратната транскриптаза има ръб върху него-малко три ензимна aktivnos-tyami:

· ДНК полимераза се използва в отличие ка матрица както РНК и ДНК;

· Активността на RNase Н хидролизира РНК в РНК-ДНК хибрид, но не единично или двойно верижна РНК;

са необходими за син-тезата на вирусна ДНК и ендонуклеаза Първите две дейности, както изглежда, е важно за интеграцията на вирусна ДНК в М-класиран клетките гостоприемници. # 946; обратна транскриптаза субединица притежава всички три дейности, докато # 940; субединица - само полимераза и RNase Н.

Пречистена обратна транскриптаза син-ДНК ziruet както РНК и ДНК-мат-ritsah. За да започнете синтез, обратната транскриптаза, както и други полимерази, необходими за кратко двойно усукана парцел - грунд. Праймерът може да бъде едноверижен сегмент на РНК, така и на ДНК, който процес REA-ЛИЗАЦИЯ са ковалентно свързани към ДНК верига новопроизведени.

Обратната транскриптаза е за предпочитане да се използва за транскрипция на РНК в комплементарна ДНК (кДНК). обратна транскрипция Реакционната об се извършва в присъствието на силни инхибитори на RNase активност. По този начин е възможно да се получи пълната дължина на DNA копие на целеви РНК молекули. Тъй като праймер с обратна транскрипция на поли (А) съдържащ иРНК, използвайки олиго (дТ) (фиг.) И за РНК молекули, които не са на кипене-3'-поли (А) край - химичен синтез Rowan oligonukleotndy комплементарна 3 'края на РНК под изследване. В допълнение, последната NY вида на РНК молекули могат да бъдат превърнати в поли (А) съдържащ използване на поли (А) полимераза Е.коли.

След синтеза на иРНК ДНК комплементарна верига и унищожаване РНК (обикновено пръв nyayut алкално третиране) се извършва син-MES втора ДНК нишка. Така възможността да се използва обратна транскриптаза за образуване на 3'-CON Zach едноверижни кДНК samokomplementar целия шипове, които могат да изпълняват функцията на праймер-нето. Шаблонът служи като първа верига кДНК. Тази реакция може да бъде катализирана от двете обратна транскриптаза и ДНК полимераза I Е. ко-ли. Комбинацията от тези два ензима увеличава добива на пълноценни сДНК молекули двойноверижни.

При завършване на синтезата на първата и втората нишка сДНК остава ковалентно свързан фуркетна бримка, която служи като праймер за синтеза на втората верига. Този цикъл се разцепва от ендонуклеаза S1, специфично унищожаване едноверижни нуклеинови киселини сайтове. По-razuyuschiesya краищата не винаги се оказват vayutsya-тъп и ремонтират да притъпи с Klenow фрагмент на ДНК полимераза I E.coli, за подобряване на ефективността-ност последващо клониране. Получената dvuhtse-бъбрек сДНК след това може да се вгради в ЦЗВ-nating вектори се размножават в част GIB Ridnyi ДНК молекули и да се използват за по-нататъшни изследвания.