генното инженерство
Изследването на ДНК молекули,
През последните години, методи за ДНК тестове получени огромно развитие. Сред най-подобрени методите, чрез които ДНК проучен включва методи за създаване на ДНК молекули от присъединяването последователности с доста различен произход. Полученият продукт се нарича рекомбинантна ДНК.
Рекомбинантната ДНК включва ген (или гени) и вектор. Вектор - ДНК фрагмент, който осигурява размножаване хибридна ДНК синтез и активност на крайните продукти на генетична система - протеини. Основните проучвания са били извършени върху бактериите и вирусите, тъй като те са сред най-прости организми, другаде наричани клетки, за "магистър". Рекомбинантна ДНК технология позволява да се получи генетични модифицирани версии, насочени и стриктно контролиран начин.
Как тогава гените на висшите организми могат да бъдат въведени в бактериалните клетки? Най-разпространеният метод е метод на генното инженерство рекомбинантна ДНК, т. Е. съдържаща чужд ген плазмиди. Плазмидите са кръгова двойноверижна ДНК молекула, състояща се от няколко килобази. Всяка бактерия, в допълнение към основните, не оставяйки клетъчна ДНК (5106 базови двойки) може да съдържа няколко различни плазмиди която комуникира с други бактерии.
Плазмидите са автономни генетични повторения (т. Е. умножение) в бактериалната клетка не е в същото време, че основната ДНК молекула. Въпреки плазмиди съставлява само една малка част от ДНК на клетката, те са такива важни гени за бактерии като медикамент резистентни гени. Различните плазмиди съдържат различни гени на резистентност към антибиотици. Лесно плазмиди устройство и лекотата, с която те са "включен" и "изход" от бактериите използват генетични инженери за въвеждане на гени в бактериални клетки на висшите организми.
Мощен инструмент за генното инженерство са открити през 1974 г., ензими - ендонуклеаза или ограничение ензим.
Ограничаване буквално означава "ограничение". Бактерии клетки произвеждат рестрикционен ензим за разграждане на чужд (предимно фагова ДНК), е необходимо да се ограничи вирусна инфекция. Рестрикционни ензими "разпознават" специфична последователност от нуклеотиди в ДНК (така наречените сайтове - разпознаване на обекти), и допринася симетрични прекъсвания в ДНК нишки на равни разстояния от центъра на обекта. В резултат на това в краищата на всеки фрагмент ограничен краткосрочен едноверижна ДНК образувана "опашки", които се наричат "лепливите краища".
От различните видове бактерии има около петстотин различни рестрикционни ендонуклеази, които са описани рестрикционни сайтове.
Методите на генното инженерство
За рекомбинантна плазмидна ДНК от плазмид се разцепва с избран рестрикционен ензим. Гените, които трябва да влиза в бактериалната клетка, отделят хромозоми на човешка ДНК със същия рестрикционен ензим, така че е "лепливите краища" са комплементарни нуклеотидни секвенции в краищата на плазмида. Ензим лигаза "омрежен" двата края на ДНК (генни и плазмид), получени в рекомбинантен плазмид пръстен, който се въвежда в бактерия Е. коли. Всички потомци на бактерии, наречени клонинг и съдържат чужд ген плазмиди, способни да произвеждат кодиран от този ген протеин.
Целият процес на получаване на тези бактерии се нарича клониране. Тя се състои от последователни етапи (фигура 3.3.):
1. Ограничаване - човешка ДНК нарязани с рестрикционен ензим в множество различни фрагменти, но със същите "лепливи" краища. Същите краища, получени чрез нарязване на плазмидна ДНК от същия рестрикционен ензим.
Фиг. 3.3. Въвеждане на гена в Ешерихия коли плазмид и клониране на гена в клетки на Е.коли
Плазмидът E.coli разцепва при специфичен сайт за рестрикционна ендонуклеаза на двете ДНК вериги, така че краищата на смляната плазмидна намира кратко несдвоен последователност на дезоксирибонуклеотиди (AATT или TTAA), т. Е. четири нуклеотидни бази, представени в който аденин и тимин.
Генът да бъде вмъкнат в плазмид чрез подразделят със същия рестрикционен ензим, така че нейните краища са комплементарни нуклеотидни последователности на краищата на плазмид (AATT и TTAA).
И двете DNA (плазмид и ген) се лигира заедно с помощта на лигаза. След това, на рекомбинантен плазмид се въвежда в клетки на Е. коли, които се размножават, образуват клон kotorog всички клетки съдържат рекомбинантен плазмид, и следователно чуждия ген. Последният сега клонира в E.coli клетки и индуцира синтеза на това spetsificheskogobelka.
2. лигиране - включването на човешка ДНК фрагмент в плазмида поради омрежване "лепливите краища" лигаза ензим.
3. Трансформация - въвеждане на рекомбинантни плазмиди в бактериални клетки, обработени по специален начин - така че те момент да стане пропусклива за макромолекули. Въпреки това, плазмени MFAs проникват само част от третираните бактерии. Те са разделени с помощта на специфична среда (например, антибиотик разтвор). Всяка от трансформираните бактерии се размножава и образува колонии на много хиляди потомци - клонинг.
4. скрининг - избор на клонинги на трансформираните бактерии включват тези, които запазват плазмид, носещ човешкия ген.
Не винаги е възможно точно да се намали ген чрез използване на рестрикционни ензими. Много гени се разцепват от тези ензими в няколко части, или не съдържат последователности, които се разпознават от рестрикционни ензими. Поради това, в някои случаи процеса на клониране не започне с режещи хромозомата на произволни ДНК фрагменти, и да се получи желаният насочени ген.
За тази цел, от човешки клетки е изолиран и РНК, която е транскрипционен копие на гена, и от ензима - обратна транскриптаза (обратна транскриптаза) - синтезира комплементарна ДНК верига, последвано от m-RNA, матрицата по време на синтеза на ДНК се разрушава RNase - специален ензим, способен да хидролизира РНК верига. Останалите ДНК верига служи като матрица за синтеза на обратната транскриптаза (ДНК полимераза) комплементарна втора ДНК нишка.
Получената двойната спирала на ДНК се нарича сДНК (комплементарна ДНК), това отговаря на ген от които е разгледана и РНК. Тази сДНК е включен в плазмид, който ще се трансформира бактерии и клонове се получават съдържащ само избраните човешки гени.
LV Тимошенко, MV Chubik